المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة
Summary
We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.
Abstract
The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.
Introduction
على الرغم من صرف الجيني بين خليتين هو الحدث المركزي في التكاثر الجنسي، فإنه يعتمد على سلسلة من الفعاليات التي تعزز تمايز الخلايا، والسماح للاختيار الشريك، والقيام الانصهار خلية خلية والحفاظ على الاستقرار الجيني. وهكذا تقدم دورة الحياة الجنسية نفسها كنظام نموذج لدراسة عدد من المسائل الحيوية المتعلقة مفاتيح التنموية، والاستجابة للمؤثرات خارجي، والانصهار غشاء البلازما والعزل الصبغي، الخ استكشاف الانشطار الخميرة دورة الجنسية لدراسة هذه الظواهر يجلب فوائد لل علم الوراثة قوية نظام النموذج، راسخة النهج الإنتاجية العالية والفحص المجهري متطورة. الجنس في الخميرة الانشطار هو حدث مغاير بين P-خلية وM-خلية من أنواع التزاوج متميزة. أنواع الخلايا اثنين من التعبير عن تفاضلي عدد من الجينات 1،2 بما في ذلك لإنتاج P- يفرز وM-الفيرومونات، فرمون مستقبلات Map3 وMam2 وكذلك فرمون-بروتيإس إي إس Sxa1 وSxa2. سلالات Homothallic، مثل سلالة H90 شيوعا، وتحمل المعلومات الوراثية لكلا النوعين التزاوج في الجينوم واحد والخلايا الخضوع لنمط معقد من نوع التزاوج التبديل طوال دورة حياة الإنقسامية (إعادة النظر في المرجع 3). كما تستخدم عزلة متعددة من الخميرة الانشطار heterothallic التي نادرا أو أبدا تبديل نوع التزاوج عادة 4، أبرزها ح + N (P-نوع) وح -S (M-نوع) السلالات.
في الخميرة الانشطار، دخول دورة حياة جنسية قيد التنظيم الغذائي الصارم. فقط خلايا الخميرة الانشطار المتعطشة النيتروجين تعتقل الاستنساخ الإنقسامية وتنتج الفيرومونات إنتشاري للإشارة إلى وجود شريك التزاوج وتشجيع المزيد من الخطوات للدورة الجنسية (إعادة النظر في المرجع 5). الحرمان من النيتروجين دي يقمع المنظم النسخي رئيسيا من Ste11 التزاوج الذي يعمل بمثابة مفتاح التنمية ويعزز هxpression من التزاوج جينات معينة بما في ذلك مستقبلات فرمون وفرمون جينات إنتاج 6،7. مشاركة فرمون مستقبلات ينشط يقترن مستقبلات البروتين G-ألفا والمصب إشارات MAPK الذي يعزز ذلك من Ste11 النشاط النسخي 8-10، وبالتالي زيادة إنتاج فرمون في ردود الفعل الإيجابية بين شركاء التزاوج. مستويات فرمون حاسمة للحث على مختلف الدول خلية الاستقطاب من خلال تنظيم منظم سيد قطبية الخلية، رو-عائلة GTPase Cdc42 11. عند التعرض لتركيزات منخفضة فرمون، هو تصور نشط Cdc42 في بقع حيوية استكشاف محيط الخلية، ويلاحظ أي نمو الخلايا في هذه المرحلة. زيادة مستويات فرمون تعزيز استقرار النشاط Cdc42 إلى منطقة واحدة ونمو إسقاط الاستقطاب، ووصف shmoo، الذي يجمع خلايا شريك في الاتصال. وفي وقت لاحق، وهما شركاء التزاوج فرداني تلتحم لتشكل البيضة الملقحة مضاعفا. العمل الأخير يكشف عشرالبريد جود هيكل الأكتين رواية ضروري لالانصهار التي يتم تجميعها من قبل formin الناجم عن التزاوج Fus1 12. هذا التركيز الانصهار يركز العمليات تعتمد نوع-V الميوسين ومواقف آلية تدهور جدار الخلية، مما يتيح إعادة تشكيل جدار الخلية للسماح البلازما غشاء الاتصال دون خلية تحلل 12. على الانصهار خلية خلية، ونوى تأتي في اتصال وتخضع تزاوج نووي. والتي تعتمد على داينين بارزة حركة ذهابا وإيابا للنواة داخل البيضة الملقحة (حركة ذيل حصان) ثم يشجع على المزاوجة بين homologs كروموسوم 13،14، والتي تبعتها الانقسام الاختزالي. وأخيرا، يتم تعبئتها المنتجات أربعة من الانقسام الاختزالي إلى جراثيم الفردية خلال تبوغ.
بسبب تعقيدها والخطوات العديدة المشاركة، ورصد تفصيلي من التزاوج تم تحديا. اثنين من الصعوبات البارزة هي أن العملية برمتها تستغرق ما يزيد على خمس عشرة ساعة وأن الخلايا هي صعبة لمزامنة. هذه دالالتفاف ifficulties بنهج المجهر وحيدة الخلية. هنا بروتوكول العام للتحقيق وتقديم دورة حياة الجنسية في الخميرة الانشطار. مع تعديلات طفيفة، يسمح هذا البروتوكول دراسة جميع الخطوات المختلفة لهذه العملية، وهي تحريض منتج الجين التزاوج، الاستقطاب الخلية والاقتران بين خلايا شقيقته بعد نوع التزاوج التحويل وبين شركاء غير شقيقة، والانصهار خلية خلية، وبعد الانصهار الحصان ذيل الحركة، الانقسام الاختزالي والتجرثم. يسمح هذا الأسلوب ل1) بسهولة الموسومة تصور fluorescently البروتينات مع مرور الوقت ما قبل وأثناء وبعد الانصهار. 2) تميز سلوك خلايا المعاكس نوع التزاوج. و3) قياس وتحديد المعايير مثل shmooing، التزاوج، والانصهار أو كفاءة تبوغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
الظروف البيئية، وتوافر المواد الغذائية على وجه الخصوص، تؤثر بقوة على علم وظائف الأعضاء الانشطار الخميرة. النيتروجين المجاعة ضروري للالتزام التكاثر الجنسي ويؤدي إلى ضرب التغيرات في الإنقسامية تقدم دورة الخلية (المرجع 21) والشكل (2) في البداية. على إزالة…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد AV من قبل EMBO على المدى الطويل زمالة ما بعد الدكتوراه. ويتم تمويل البحوث في مختبر مارتن من منحة ERC البداية (GeometryCellCycle) ومنحة مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_155944) إلى SGM.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2.6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4.5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
Referências
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
