Microscopie de levure Fission Lifecycle sexuelle
Summary
We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.
Abstract
The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.
Introduction
Bien que l'échange génétique entre deux cellules est l'événement central dans la reproduction sexuée, elle repose sur une chaîne d'événements qui favorisent la différenciation des cellules, permettent le choix du partenaire, réalisent la fusion cellule-cellule et de maintenir la stabilité du génome. Ainsi , le cycle de vie sexuelle se présente comme un système modèle pour étudier un certain nombre de questions biologiques en ce qui concerne les commutateurs de développement, réponse à des stimuli extrinsèques, la fusion de la membrane plasmique, la ségrégation des chromosomes, etc. Exploring la levure de fission de cycle sexuel pour étudier ces phénomènes apporte les avantages de la génétique puissant système de modèle, bien établi des approches à haut débit et la microscopie sophistiquée. Le sexe dans la levure de fission est un événement hétérotypique entre un P-cellulaire et un M-cellulaire des types d'accouplement distincts. Les deux types de cellules expriment différemment un certain nombre de gènes 1,2 , y compris ceux pour la production du P- sécrétée et M-phéromones, phéromone-récepteurs Carte3 et Mam2 ainsi que phéromone-proteaSES Sxa1 et Sxa2. Homothalliques souches telles que la souche H90 couramment utilisée, portent l'information génétique pour les deux types d'accouplement en un seul génome et les cellules subissent un schéma complexe de commutation de type conjugaison au long du cycle mitotique (passé en revue dans réf. 3). Isolats multiples de hétérothallique levure de fission que rarement ou jamais changer le type d'accouplement sont également couramment utilisés 4, le plus en évidence le h + N (type P) et h -S (type M) souches.
Dans la levure de fission, l'entrée dans le cycle de vie sexuelle est sous la réglementation nutritionnelle stricte. Seules les cellules de levure fission azote affamés arrêtent la reproduction mitotique et produisent des phéromones diffusibles pour signaler la présence d'un partenaire d'accouplement et de promouvoir d' autres étapes du cycle sexuel (revu en. Ref 5). Privation d'azote de-refoule le régulateur transcriptionnel clé de Ste11 accouplement qui agit comme un commutateur et favorise le développement eXpression d'accouplement des gènes spécifiques , y compris le récepteur de phéromone et la phéromone des gènes de production 6,7. L' engagement phéromone-récepteur active la protéine du récepteur couplé à G-alpha et la signalisation MAPK aval qui améliore encore l' activité transcriptionnelle Ste11 8-10, augmentant ainsi la production de phéromone dans une rétroaction positive entre les partenaires d'accouplement. Les niveaux de phéromone sont cruciales pour induire différents états de polarisation de la cellule en régulant l'organisateur principal de la polarité cellulaire, la Rho-famille GTPase Cdc42 11. Lors de l'exposition à de faibles concentrations de phéromone, Cdc42 actif est visualisé dans les patchs dynamiques explorant la périphérie de la cellule, et pas de croissance cellulaire est observé à ce stade. niveaux de phéromone accrus favorisent la stabilisation de l'activité Cdc42 à une seule zone et à la croissance d'une projection polarisée, dite shmoo, qui apporte des cellules partenaires en contact. Par la suite, les deux partenaires d'accouplement haploïdes fusionnent pour former un zygote diploïde. Des travaux récents révèle the l' existence d'une nouvelle structure essentielle pour la fusion de l' actine qui est assemblé par la Formin induite par l' accouplement-FUS1 12. Cette mise au point de fusion se concentre processus dépendants de type V myosine et positionne le mécanisme de dégradation de la paroi cellulaire, permettant ainsi le remodelage de la paroi cellulaire pour permettre plasma contact membrane sans lyse cellulaire 12. Lors de la fusion cellule-cellule, les noyaux entrent en contact et subissent caryogamie. Un mouvement important va-et-vient dynein dépendant du noyau à l' intérieur du zygote (le mouvement de queue de cheval) favorise alors l'appariement des chromosomes homologues de 13,14, qui est suivie par la méiose. Enfin, les quatre produits de la méiose sont emballés dans des spores individuelles pendant la sporulation.
En raison de sa complexité et les nombreuses étapes, un suivi détaillé de l'accouplement a été difficile. Deux difficultés notables sont que l'ensemble du processus prend bien plus de quinze heures, et que les cellules sont difficiles à synchroniser. Ces difficulties sont contournées par des approches de microscopie à cellule unique. Voici un protocole général pour enquêter sur le cycle de vie sexuelle dans la levure de fission est présenté. Avec quelques ajustements mineurs, ce protocole permet l'étude de toutes les différentes étapes du processus, à savoir l'induction du produit du gène d'accouplement, la polarisation de la cellule et l'appariement entre les sœurs cellules après commutation du type d'accouplement et entre les partenaires non-soeur, fusion cellule-cellule, et post-fusion queue de cheval mouvement, la méiose et la sporulation. Cette méthode permet de 1) facilement visualiser les protéines marquées par fluorescence dans le temps avant, pendant et après la fusion; 2) discriminer le comportement des cellules du type opposé de l'accouplement; et 3) mesurer et quantifier les paramètres tels que shmooing, l'accouplement, la fusion ou de l'efficacité de la sporulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les conditions environnementales, et la disponibilité des nutriments, en particulier, affectent fortement la physiologie fission de la levure. Azote famine est nécessaire à l' engagement de la reproduction sexuée et conduit à des changements frappants dans la progression du cycle cellulaire mitotique (Réf. 21 et figure 2) au départ. Lors de l' élimination de l' azote de la population en croissance exponentielle, la taille des cellules à division diminue rapidement <strong…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AV a été soutenu par une bourse de recherche postdoctorale EMBO à long terme. La recherche dans le laboratoire Martin est financé par une subvention de démarrage du CER (GeometryCellCycle) et une subvention nationale suisse Science Foundation (31003A_155944) à SGM.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2.6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4.5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
Referências
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
