分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察
Summary
We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.
Abstract
The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.
Introduction
2セル間の遺伝子交換が有性生殖で中央イベントですが、それは細胞の分化を促進する一連のイベントに依存して、相手の選択を可能にする、細胞 – 細胞融合を行い、ゲノムの安定性を維持します。したがって、性的ライフサイクルが発達スイッチに関する生物学的な質問の数を研究するためのモデル系としての地位を提示し、分裂酵母、これらの現象を研究するための性周期を探るなど 、外因性の刺激、形質膜融合、染色体分離、に対する応答はのメリットをもたらしますモデル系の強力な遺伝学、十分に確立された高スループットのアプローチと洗練された顕微鏡。分裂酵母でのセックスは、異なる交配型のP-細胞およびM-セル間の異イベントです。 2つの細胞型は、示差分泌P-の生産のためのものと、M-フェロモン、フェロモン受容体MAP3とMam2だけでなく、フェロモンプロテア含む遺伝子1,2の数を表しますSES Sxa1とSxa2。このような一般的に使用されるH90株とホモタリック株は、交配単一ゲノム内の型と細胞の両方のための遺伝情報を運ぶ（参考文献3に概説されている）有糸分裂のライフサイクルを通じて交配型スイッチングの複雑なパターンを受けます。まれまたは決して交配型を切り替えない異体性の分裂酵母の複数の分離株は、一般に、H + N（P型）と時間 -S（M型）株最も顕著に、4を使用しています。
分裂酵母では、性的なライフサイクルへの参入は厳しい栄養規制下にあります。窒素のみ飢餓分裂酵母細胞は分裂再生を逮捕し、交配相手の存在を知らせると（文献5に概説されている）性周期の更なるステップを促進するための拡散性フェロモンを生産します。窒素欠乏が発達スイッチとして機能し、電子を促進し、相手STE11の鍵転写調節因子を脱抑制するフェロモン受容体とフェロモン産生遺伝子6,7を含む特定の遺伝子を交配のXPRESSION。フェロモン受容体の関与は、さらにこのように、相手先との間に正のフィードバックにフェロモン産生を増加させる、STE11転写活性8-10を増強受容体結合タンパク質G-αおよび下流のMAPKシグナル伝達を活性化させます。フェロモンレベルは、細胞極性、のRhoファミリーのGTPaseのCdc42 11のマスター主催を調節することにより、異なる細胞偏光状態を誘導するために重要です。低フェロモン濃度に曝されると、アクティブCdc42のは、細胞周辺を探索動的パッチで可視化され、何の細胞増殖は、この段階で観察されません。増加したフェロモンレベルは、単一のゾーンと偏突起の成長へのCdc42活性の安定化を促進し、接触してパートナー細胞をもたらすシュムーを、と呼ばれます。続いて、2半数体交配パートナーは、二倍体接合体を形成するために融合します。最近の研究は目を明らかに交配によって誘導されるformin FUS1 12によって組み立てられている核融合のために必須の新規アクチン構造の電子的存在。この融合フォーカスは、タイプVミオシン依存性プロセスが集中し、したがって、細胞壁のリモデリングは、細胞溶解12なしで細胞膜との接触を可能にすることができ、細胞壁分解機構を位置決めします。細胞 – 細胞融合の際に、核が接触し、核合体を受けます。接合体（馬の尾の動き）の内側核の著名なダイニン依存往復運動は、その後減数分裂が続いている染色体ホモログ13,14のペアリングを促進します。最後に、減数分裂の4つの製品は、胞子形成中に個々の胞子にパッケージ化されています。
理由は、その複雑さと関連する多数の工程で、交配の詳細な監視が挑戦されています。二つの注目すべき困難が全体のプロセスはよく15時間以上を要すること、細胞が同期することが困難であるということです。これらのDifficultiesは、単一細胞の顕微鏡的アプローチによって回避されます。ここでは分裂酵母に性的なライフサイクルを調査するための一般的なプロトコルが提示されています。微調整では、このプロトコルは、プロセスのすべての異なる段階、すなわち遺伝子産物を交配の誘導、交配型スイッチング後の姉妹細胞間の細胞極性とペアリングと非姉妹パートナー、細胞 – 細胞融合、間の研究を可能にしますそして、融合後馬の尾の動き、減数分裂と胞子形成。この方法は、簡単かつ融合後の間に、時間前にわたってタンパク質を蛍光タグ付けされた可視化）を1にできます。 2）反対の接合型の細胞の挙動を識別する。 3）このようなshmooing、交配、融合または胞子形成効率などのパラメータを測定し、定量化します。
Protocol
Representative Results
Discussion
環境条件、特に栄養利用は、強く分裂酵母の生理機能に影響を与えます。窒素飢餓は、有性生殖へのコミットメントのために必要であると最初に分裂細胞周期の進行（参考文献21および図2）での印象的な変化をもたらします。指数関数的に増加する人口からの窒素除去の際に、部門のセルサイズは急速に（ 図2C）減少し、細胞の大部分は、新たに生まれた指?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AVはEMBO長期ポスドクフェローシップによってサポートされていました。マーティンラボでの研究は、SGMにERCの起動許可（GeometryCellCycle）とスイス国立科学財団の助成金（31003A_155944）によって運営されています。
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2.6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4.5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
Referências
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