Microscopie van Fission Yeast Sexual Lifecycle
Summary
We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.
Abstract
The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.
Introduction
Hoewel genetische uitwisseling tussen twee cellen is de centrale gebeurtenis in geslachtelijke voortplanting, beroept zij zich op een keten van gebeurtenissen die celdifferentiatie te bevorderen, zorgen voor partnerkeuze, het uitvoeren van cel-cel fusie en genomische stabiliteit te handhaven. Aldus presenteert de seksuele levenscyclus zich als een modelsysteem om een aantal vragen omtrent ontwikkelingsstoornissen schakelaars bestuderen reactie op extrinsieke stimuli, plasma membraanfusie, chromosoomsegregatie, enz Exploring the splijtgist seksuele cyclus van deze fenomenen te bestuderen brengt de voordelen van de de modelsysteem krachtige genetica, gevestigde high-throughput benaderingen en geavanceerde microscopie. Sex in kernsplijting gist is een heterotypic evenement tussen een P-cel en een M-cel van verschillende soorten paring. De twee celtypen verschillend drukken een aantal genen waaronder die 1,2 voor de productie van de uitgescheiden P- en M-feromonen, feromoon-receptoren map3 en Mam2 en feromoon-proteases Sxa1 en Sxa2. Homothallic stammen, zoals de gebruikte stam H90, dragen de genetische informatie voor beide paren in een genoom en cellen ondergaan een complex patroon van paringstype schakelen gedurende de mitotische levenscyclus (besproken in ref. 3). Meerdere isolaten van heterothallisch splijtgist die zelden of nooit schakel mating type worden ook vaak gebruikt 4, het meest opvallend h + N (P-type) en h -S (M-type) stammen.
In kernsplijting gist, de toegang tot de seksuele levenscyclus is onder strikte nutritionele regelgeving. Alleen stikstof verhongerde splijtingsproducten gistcellen arresteren mitotische voortplanting en produceren diffundeerbare feromonen om de aanwezigheid van een seksuele partner te signaleren en de verdere stappen van de seksuele cyclus (beoordeeld in ref. 5) te promoten. Stikstof ontbering de-onderdrukt de sleutel transcriptionele regulator van de paring Ste11 die fungeert als een ontwikkelings-switch en bevordert eXpression van paring specifieke genen met inbegrip van het feromoon receptor en de feromoonproductie genen 6,7. Feromoon-receptor betrokkenheid activeert de receptor gekoppelde eiwit G-alfa en downstream MAPK signalering die verder verbetert Ste11 transcriptionele activiteit 8-10, waardoor de feromonen productie in een positieve terugkoppeling tussen de paring partners. Pheromone niveaus zijn cruciaal voor andere cel polarisatie toestanden te induceren door het reguleren van de meester organisator van de cel polariteit, de Rho-familie GTPase Cdc42 11. Bij blootstelling aan lage concentraties feromoon wordt actief Cdc42 gevisualiseerd dynamische pleisters verkennen van de cel periferie en geen celgroei waargenomen in dit stadium. Verhoogde feromoon niveaus bevorderen van de stabilisering van de Cdc42 activiteit aan één zone en de groei van een gepolariseerde projectie, aangeduid als de Shmoo, welke partner cellen in contact brengt. Vervolgens worden de twee haploïde parende partners fuseren van een diploïde zygote te vormen. Recent werk onthult the bestaan van een nieuwe actine structuur essentieel voor fusie die is samengesteld door de paring geïnduceerd formin FUS1 12. Deze fusie aandacht concentreert type V myosine afhankelijke processen en positioneert het celwandafbraak machines, waardoor remodelleren van de celwand plasmamembraan contact zonder cellyse 12 mogelijk. Bij het cel-cel fusie, de kernen in contact komen en ondergaan karyogamie. Een prominente dynein afhankelijke heen en weer bewegen van de kern in de zygote (paard-tail beweging) bevordert vervolgens de koppeling van chromosoom homologen 13,14, gevolgd door meiose. Tenslotte de vier producten van meiose worden verpakt in afzonderlijke sporen tijdens sporulatie.
Vanwege de complexiteit en de vele stappen die betrokken zijn, heeft gedetailleerde monitoring van de paring is uitdagend. Twee opmerkelijke problemen zijn dat het hele proces duurt meer dan vijftien uur en dat cellen moeilijk te synchroniseren. deze difficulties worden omzeild door eencellige microscopie benaderingen. Hier wordt een algemeen protocol om te onderzoeken van de seksuele levenscyclus in kernsplijting gist wordt gepresenteerd. Met kleine aanpassingen Dit protocol maakt het bestuderen van de verschillende stappen van het proces, namelijk de inductie van paring genproduct celpolarisatie en paring tussen zuster-cellen na mating type schakel- en tussen niet-zuster partners, cel-celfusie en post-fusie horse-tail beweging, meiose en sporulatie. Deze methode maakt het mogelijk om 1) gemakkelijk te visualiseren fluorescent gelabelde eiwitten in de tijd vóór, tijdens en na de fusie; 2) discriminatie het gedrag van cellen van tegengestelde mating; en 3) het meten en kwantificeren van parameters zoals shmooing, paring, fusie of sporulatie efficiency.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eisen aan de omgeving, en de beschikbaarheid van voedingsstoffen in het bijzonder, sterk van invloed op de kernsplijting gist fysiologie. Stikstoftekort is noodzakelijk inzet voor de geslachtelijke voortplanting en aanvankelijk leidt tot opvallende veranderingen in de mitotische celcyclus (Ref. 21 pt figuur 2). Na stikstofverwijdering uit exponentieel groeiende bevolking, celgrootte bij deling snel af (figuur 2C) en de meerderheid van de cellen arrestatie mitotische progressi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AV werd ondersteund door een EMBO lange termijn postdoctoraal fellowship. Onderzoek in het Martin lab wordt gefinancierd door een ERC Starting Grant (GeometryCellCycle) en een Zwitserse National Science Foundation subsidie (31003A_155944) naar SGM.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2.6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4.5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
Referências
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
