분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경
Summary
We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.
Abstract
The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.
Introduction
두 셀 간의 유전자 교환 유성 생식의 중앙 이벤트이지만, 그것은 세포 분화를 촉진 파트너의 선택을 허용, 세포 – 세포 융합을 수행하고 유전체의 안정성을 유지하는 일련의 사건에 의존한다. 따라서 성적 기간이 발달 스위치 관련 생물학적 질문들을 연구하는 모델 시스템 자체를 제시 분열 효모 이러한 현상을 연구 성적 사이클 탐색 등의 외적 자극 세포막 융합, 염색체 분리에 반응의 이점을 가져온다 모델 시스템의 강력한 유전학, 높은 처리량 방법과 정교한 현미경을 잘 설립. 분열 효모에서 섹스는 P-셀과 별개의 결합 유형의 M 세포 사이의 이형 이벤트입니다. 두 세포 유형은 차동 분비 P- 생산 및 M-페로몬, 페로몬 수용체 map3 체크하고 Mam2뿐만 아니라 페로몬 테아위한 포함한 유전자 1,2-들을 표현할SES Sxa1 및 Sxa2. 이러한 일반적으로 사용 H90 균주로서 Homothallic 균주, 단일 게놈 모두 결합 타입 유전 정보를 전달 및 세포 (참조. 3에서 검토) 분열주기에 걸쳐 결합 형 스위칭 복잡한 패턴을 겪는다. 거의 또는 전혀 결합 유형을 전환하지 heterothallic 분열 효모의 여러 균주는 일반적으로 가장 눈에 띄게, H + N (P 형) 및 시간 -S (M 형) 균주를 4를 사용한다.
분열 효모에서 성적 라이프 사이클에 진입 엄격한 영양 조절을 받고있다. 만 질소에 굶주린 분열 효모 세포 유사 분열 재생을 체포하고 짝짓기 파트너의 존재를 신호하고 (참조. 5에서 검토)의 성적 사이클의 추가 단계를 촉진 확산 성 페로몬을 생산하고 있습니다. 질소 부족의 발달 스위치 역할을하며 전자를 촉진 상대 Ste11의 주요 전사 조절을 드-억압페로몬 수용체와 페로몬 생산 유전자 6,7를 포함하여 특정 유전자 짝짓기의 xpression. 페로몬 수용체의 결합은 더욱 따라서 짝짓기 파트너 사이의 긍정적 인 피드백에 페로몬 생산을 증가, Ste11 전사 활동 8-10을 향상 수용체 결합 단백질 G 알파 및 다운 스트림 MAPK 신호를 활성화합니다. 페로몬 수준은 세포 극성의 Rho 가족는 GTPase Cdc42 (11)의 마스터 주최자를 조절하여 다른 세포 편광 상태를 유도하기에 매우 중요하다. 페로몬 낮은 농도에 노출시 활성 Cdc42은 세포 주위를 둘러 동적 패치 시각화하고, 어떤 세포 성장이 단계에서 관찰되지 않는다. 증가 페로몬 레벨 단일 영역과 편광 돌기의 성장에 Cdc42 활동의 안정화를 촉진 접촉 상대 세포를 제공 내가 어릴 때 좋아했던 연재 만화를 불린다. 이어서, 두 개의 반수체 결합 파트너 배체의 접합자를 형성하는 퓨즈. 최근 작품은 일을 계시상대 유도 formin FUS1 (12)에 의해 조립 융합에 필수적인 새로운 액틴 구조의 전자의 존재. 이 융합 포커스 따라서 세포 용해 (12)없이 세포막의 접촉을 허용하도록 칸막이 벽의 개장을 허용 타입 V 미오신 종속 프로세스 집중과 세포벽 분해 장치를 위치. 세포 – 세포 융합 후, 핵 접촉하고 karyogamy을 겪는다. 접합자 (말 꼬리 운동) 내부 핵의 눈에 띄는 네인 의존 전후 운동은 감수 분열 뒤에 염색체 상 동체 (13, 14)의 페어링을 촉진한다. 마지막으로, 감수 분열의 네 제품은 포자 동안 개별 포자로 포장됩니다.
때문에 복잡성과 관련된 수많은 단계, 상대의 상세한 모니터링에 도전하고있다. 두 주목할만한 문제는 전체 프로세스가 아니라 다섯 시간 이상을 소요하고 세포를 동기화하기 어려운 것이 있습니다. 이 라ifficulties은 단일 셀 현미경 접근 방식에 의해 피할 수 있습니다. 여기에 일반적인 프로토콜은 분열 효모의 성적 라이프 사이클이 제시 조사합니다. 약간의 조정으로,이 프로토콜은 프로세스의 모든 다른 단계, 상대 유전자 산물, 비 자매 파트너 짝짓기 형 스위칭 후 자매 세포 사이 사이에 셀 편광 및 페어링, 세포 – 세포 융합, 즉 유도의 연구를 허용, 및 사후 융합 말 꼬리 운동, 감수 분열과 포자. 이 방법은 쉽게 시각화 형광 동안 및 사후 융합, 시간 사전을 통해 단백질 태그)을 1로 할 수 있습니다; 2) 대향 결합 형 세포의 행동을 식별; 3) 측정 및 shmooing, 결합, 융합 또는 포자 효율과 같은 매개 변수를 정량화.
Protocol
Representative Results
Discussion
환경 조건, 영양 가용성은 특히 강하게 분열 효모의 생리에 영향을 미칩니다. 질소 기아는 유성 생식에 헌신 필요하고 초기에 유사 분열 세포주기 진행에 눈에 띄는 변화 (참조. 21 및 그림 2)에 연결됩니다. 기하 급수적으로 증가하는 인구에서 질소 제거 후, 부문 셀 크기가 빠르게 (도 2C) 감소하고 세포의 대부분은 새로 태어난 기하 급수적으로 성장 세포 (참조. <s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AV는 EMBO 장기 박사 친교에 의해 지원되었다. 마틴 실험실에서 연구 ERC 시작 부여 (GeometryCellCycle)과 SGM에 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 (31003A_155944)에 의해 투자된다.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2.6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4.5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
Referências
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