Mikroskopi av Fisjon gjær Seksuell Lifecycle

Summary

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Abstract

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

Introduction

Selv om genetisk utveksling mellom to celler er den sentrale hendelsen i seksuell reproduksjon, det er avhengig av en kjede av hendelser som fremmer celledifferensiering, gir mulighet for valg av partner, utfører celle-celle fusjon og vedlikeholde genomisk stabilitet. Dermed seksuell livssyklus presenterer seg som et modellsystem for å studere en rekke biologiske spørsmål om utviklings brytere, reaksjon på ytre stimuli, plasma membran fusion, kromosom segregering, osv Exploring fisjons gjær seksuell syklus for å studere disse fenomenene bringer fordelene av modellsystem kraftige genetikk, veletablerte high-throughput tilnærminger og sofistikert mikroskopi. Sex i fisjon gjær er en heterotypic hendelse mellom en P-celle og en M-celle distinkte parring typer. De to celletyper differensielt uttrykk for en rekke gener ^1,2 inkludert de for fremstilling av det utskilte P- og M-feromoner, feromon-reseptorer Map3 og Mam2 samt feromon-proteases Sxa1 og Sxa2. Homo-thallisk-stammer, slik som vanligvis brukes H90 belastning, bærer den genetiske informasjonen for både parring typer i en enkelt genom og cellene gjennomgå en komplekst mønster av paringstypen veksling gjennom den mitotiske livssyklusen (oversikt i Ref. ^3). Multiple isolater av heterothallic spalting gjær som sjelden eller aldri bytte paringstypen er også ofte brukt ^{til 4,} mest fremtredende h ^{+ N} (P-type) og h ^-S (M-type) stammer.

I fisjon gjær, inntreden i den seksuelle livssyklus er under streng ernæringsmessig regulering. Bare nitrogen sultet fisjonsgjærceller arrestere mitotisk reproduksjon og produsere diffusible feromoner for å signalisere tilstedeværelsen av en paring partner og fremme ytterligere trinn av seksuell syklus (anmeldt i Ref. ^5). Nitrogen deprivasjon de-undertrykker nøkkelen transcriptional regulator av parring Ste11 som fungerer som en utviklings bryter og fremmer eXpression av parring spesifikke gener inkludert feromon reseptoren og feromon produksjons gener ^6,7. Pheromone-reseptor engasjement aktiverer reseptor-koblede protein G-alfa og nedstrøms MAPK signal som ytterligere forbedrer Ste11 transkripsjonen aktivitet ^8-10, og dermed øke feromon produksjonen i en positiv tilbakemelding mellom parringspartnere. Feromon nivåer er avgjørende for å indusere forskjellige celle polarisering stater ved å regulere mester arrangør av celle polaritet, Rho-familien GTPase Cdc42 ^11. Ved eksponering for lave konsentrasjoner feromon er aktiv Cdc42 anskueliggjort på dynamiske flekker utforske cellen periferi, og ikke cellevekst observeres på dette stadiet. Økte nivåer feromon fremme stabiliseringen av Cdc42 aktivitet til en enkelt sone og vekst av en polarisert fremspring, betegnet Shmoo, som bringer partnerceller i kontakt. Deretter de to haploide paring partnere sikring for å danne en diploid zygote. Nyere arbeider avslører the eksistensen av en roman aktin struktur avgjørende for fusjon som er satt sammen av parings-indusert formin Fus1 ^12. Denne fusjon fokus konsentrater type V myosin avhengige prosesser og posisjonerer celleveggen degradering maskineri, og dermed gir ombygging av celleveggen for å tillate plasmamembranen kontakt uten cellelyse ^12. Ved celle-celle fusjon, kjernen kommer i kontakt og gjennomgå karyogamy. En fremtredende dynein avhengig back-og-tilbake bevegelse av kjernen i zygoten (hestehale bevegelse) fremmer deretter sammenkoblingen av kromosom homologer ^13,14, som er etterfulgt av meiose. Endelig er de fire produkter av meiose pakket i individuelle sporer under sporulering.

På grunn av sin kompleksitet og de mange trinnene som er involvert, har detaljert overvåking av parring vært utfordrende. To kjente problemer er at hele prosessen tar godt over femten timer, og at cellene er vanskelig å synkronisere. disse difficulties blir omgått ved encellede mikros tilnærminger. Her en generell protokoll for å undersøke den seksuelle livssyklus i fisjon gjær er presentert. Med mindre justeringer, tillater denne protokollen studiet av alle de forskjellige trinnene i prosessen, nemlig induksjon av parring genprodukt, celle polarisering og sammenkoblingen mellom søster-celler etter Mating Typ veksling og mellom ikke-beslektede partnere, celle-cellefusjon og post-fusjon hestehale bevegelse, meiose og sporulation. Denne metoden gjør det mulig å 1) lett visualisere fluorescens-merket proteiner over tid før-, under og etter fusjon; 2) diskriminere oppførselen til celler av motsatt parrings type; og 3) måle og kvantifisere parametere som shmooing, parring, fusjon eller sporulation effektivitet.

Protocol

Mikroskopi analyse av fisjon gjær seksuell reproduksjon 1. Media Forberedelse Forbered Minimum sporulering medium (MSL-N) 15 ved å blande følgende komponenter: Glukose 10 g / l KH 2PO 4: 1 g / l, NaCl: 0,1 g / l MgSO4 · 7H 2 O: 0,2 g / L. Legg Sporstoffer (10,000x): 100 mL / L, vitaminer (1,000x): 1 ml / l og 0,1 M CaCl2   ml / l. Filter-sterilisere ved hjelp av en 0,22 mikrometer porestørrelse filter og oppbevares …

Representative Results

Fisjons Gjær Vekst og Mating Dynamics ved fjerning av en nitrogenkilde Som nitrogen sult er en forutsetning for initiering av seksuell reproduksjon i fisjon gjær, ble villtype-homo-thallisk H90 belastning overvåkes ved overgang fra nitrogen-rik på nitrogen-belastede medium (figur 2), etter den protokoll som er beskrevet i figur 1. I korthet ble cellene ble dyrket O / N til eksponensiell fase (OD600 = 0,5) i MSL + N medium, …

Discussion

Miljøforhold og næringsstoffer spesielt sterkt påvirke fisjon gjær fysiologi. Nitrogen sult er nødvendig for forpliktelse til seksuell reproduksjon og i utgangspunktet fører til slående endringer i mitotisk cellecyklusprogresjonen (Ref. ²¹ og figur 2). Ved nitrogenfjerning fra eksponentielt voksende befolkning, cellestørrelsen ved divisjon hurtig avtar (figur 2C) og flertallet av celler arrest mitotisk progresjon kortere enn lengden av nyfødte eksponentielt dyrkede c…

Materials

Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-10KG
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1.05108.0050
NaCl	Sigma-Aldrich	71381
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	63140
CaCl2	Sigma-Aldrich	12095
Pantothenate	AppliChem	A2088,0025
Nicotinic Acid	AppliChem	A0963,0100
Inositol	AppliChem	A1716,0100
Biotin	AppliChem	A0967,0250
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B6768-1KG
MnSO4	AppliChem	A1038,0250
ZnSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750
FeCl2.6H2O	AppliChem	A3514,0250
Molybdenum oxide (VI) (MoO3)	Sigma-Aldrich	69850
KI	AppliChem	A3872,0100
CuSO4.5H2O	AppliChem	A1034,0500
Citric Acid	AppliChem	A2344,0500
Agarose	Promega	V3125
(NH4)2SO4	Merck	1.01217.1000
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L8000-100G
Adenine Hemisulfat Salt, mini 99%	Sigma-Aldrich	A9126-100G
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
Lanolin	Sigma-Aldrich	L7387
Vaseline	Reactolab	92045-74-4
Paraffin	Reactolab	7005600