De productie van de mens Norovirus uitstekende Domeinen in<em> E. coli</em> Voor röntgenkristallografie
Summary
Hier beschrijven we een werkwijze uit te drukken en te zuiveren uitstekende kwaliteit norovirus (P) domeinen in E. coli voor röntgen- kristallografie studies. Deze methode kan worden toegepast op andere calicivirus P domeinen, alsmede niet-structurele eiwitten, bijv., Viraal eiwit-gekoppelde genoom (VPG), protease en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp).
Abstract
Norovirus capside is samengesteld uit een enkele belangrijke structurele eiwit VP1 genoemd. VP1 is onderverdeeld in een omhulsel (S) domein en een uitstekend (P) domein. De S-domein vormt een aaneengesloten steiger rond het virale RNA, terwijl de P-domein vormen virale spikes op de S domein en bevat determinanten voor antigeniciteit en gastheer-cel interacties. De P-domein bindt koolhydraatstructuren, dwz., Histo-bloedgroep antigenen, die vermoedelijk belangrijk norovirus infecties. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het produceren van hoogwaardige norovirus P domeinen in hoge opbrengsten. Deze eiwitten kunnen vervolgens worden gebruikt voor röntgenkristallografie en ELISA om antigeniciteit en gastheer-cel interacties te bestuderen.
De P domein wordt eerst gekloneerd in een expressievector en tot expressie gebracht in bacteriën. Het eiwit wordt gezuiverd met behulp van drie stappen die gepaard geïmmobiliseerde metaalion-affiniteitschromatografie en gelpermeatiechromatografie. Inprincipe is het mogelijk om te klonen, express, zuiveren en kristalliseren eiwitten in minder dan vier weken, die dit protocol een snel systeem voor het analyseren van opkomende norovirus stammen maakt.
Introduction
Human noroviruses zijn de belangrijkste oorzaak van acute gastro-enteritis in de wereld 1. Deze virussen behoren tot de familie Caliciviridae, waarvan er ten minste vijf geslachten, met inbegrip van Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus pt Nebovirus. Ondanks hun grote impact op de gezondheidszorg en de brede verspreiding, is de studie van de menselijke norovirussen gehinderd door het ontbreken van een robuust celcultuur systeem. Tot op heden zijn er geen goedgekeurde vaccins of antivirale strategieën beschikbaar.
Norovirus belangrijkste capside eiwit VP1 genoemd, kan worden verdeeld in een omhulsel (S) domein en een uitstekend (P) domein 2. De P-domein is verbonden met het S domein een flexibel scharnier (H) gebied. De S-domein vormt een steiger rond het virale RNA, terwijl de P-domein vormt de buitenste deel van het virale capside. P domein verzamelt in biologisch relevante dimeren bij expressie in bacteriën. De Pdimer interageert met koolhydraten structuren, genaamd histo-bloedgroep antigenen (HBGAs), die aanwezig is als oplosbare antigenen in het speeksel en te vinden op bepaalde gastheercellen 3 zijn. De P-domein HBGA interactie gedacht belangrijk voor infectie 4 te zijn. Inderdaad, een recent rapport bleek het belang van synthetische HBGAs of HBGA expressie bacteriën voor menselijke norovirus infectie in vitro 5.
Huidige studies over de gastheercel hechting van noroviruses hoofdzakelijk uitgevoerd met virusachtige deeltjes (VLP's) die kunnen worden uitgedrukt in insectencellen of recombinant P-domeinen tot expressie gebracht in Escherichia coli (E. coli). Om de P-domein-HBGA interacties op atomaire resolutie te begrijpen, kan P domein HBGA complexe structuren worden opgelost met behulp van X-ray kristallografie. We beschrijven hier een protocol P domein expressie en zuivering waarmee de productie van P-domein in hoge hoeveelheid en kwaliteit te gebruiken voor X-ray CrystallOGRAFIE. Bovendien kan deze methode worden toegepast voor andere calicivirus P domeinen en niet-structurele proteïnen.
De P domein codon-geoptimaliseerd voor E. coli expressie en gekloond in een standaard overdracht vector. De P domein wordt vervolgens opnieuw gekloneerd in een expressievector die een polyhistidine (His) tag en een mannose-bindend eiwit (MBP) die gevolgd worden door een protease-splitsingsplaats codeert. De MBP-His-P domein fusieproteïne wordt tot expressie gebracht in E. coli, gevolgd door drie zuiveringsstappen. De MBP-His-P-domein fusieproteïne gezuiverd met geïmmobiliseerd metaalion affiniteitschromatografie (IMAC). Vervolgens wordt het fusie-eiwit geknipt met humaan rhinovirus (HRV) -3C protease en de P-domein wordt van het MBP-His met een extra IMAC zuiveringsstap. Tenslotte wordt de P domein gezuiverd met size exclusion chromatografie (SEC). Het gezuiverde P domein kan dan worden gebruikt voor röntgenkristallografie. Screening van eiwit kristallisatie voorwaarden performed met commercieel verkrijgbare screening kits met behulp van verschillende P-domein eiwit concentraties. Kristalgroei wordt waargenomen en de meest veelbelovende omstandigheden worden geoptimaliseerd.
Met de hier beschreven methoden, is het mogelijk om van gen eiwit te structureren in minder dan vier weken. Daarom is onze werkwijze P domein expressie, zuivering en kristallisatie geschikt norovirus-gastheer interacties op moleculair niveau verschaffen belangrijke gegevens helpt bij up-to-date vaccinontwerp en drug discovery.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor de expressie en zuivering van norovirus P domeinen in hoge kwaliteit en kwantiteit. Norovirussen zijn niet goed bestudeerd en structurele gegevens worden voortdurend nodig. Voor zover wij weten, heeft P domein productie met behulp van andere protocollen (bv-GST gelabeld P domeinen) problematisch geweest, tot nu toe, en voldoende structurele gegevens over norovirus-gastheer interactie hebt gemist. Met de hier beschreven methode, hebben we onlangs aanzienlijk bijgedragen aan …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.
Materials
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 cm x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
Referências
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).
- Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
- Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
- Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
- Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
- Mccoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
- Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
- Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses’ fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
- Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).
