Produção de Domínios salientes Norovirus Humanos em<em> E. coli</em> Para raios-X Cristalografia

Summary

Aqui, descrevemos um método para expressar e purificar norovirus alta qualidade salientes domínios (P) em E. coli para uso em estudos de cristalografia de raios-X. Este método pode ser aplicado a outros domínios calicivírus P, bem como proteínas não estruturais, isto é., A proteína virai ligada ao genoma (VPg), protease, e polimerase de ARN dependente de ARN (RdRp).

Abstract

A cápside norovírus é composto de uma única proteína estrutural principal, denominado VP1. VP1 é subdividida em um domínio (s) casca e um domínio saliente (P). O domínio S forma um andaime contíguo em torno do ARN virai, ao passo que as formas de domínio P picos virais no domínio S e contém determinantes de antigenicidade e interacções célula-hospedeiro. O domínio P se liga a estruturas de hidratos de carbono, isto é., Antigénios do grupo histo-sangue, que se pensa ser importante para infecções norovírus. Neste protocolo, nós descrevemos um método para a produção de domínios de alta qualidade norovírus P com rendimentos elevados. Estas proteínas podem então ser utilizados para a cristalografia de raios-X e de ELISA, a fim de estudar a antigenicidade e interacções da célula hospedeira.

O domínio P é em primeiro lugar clonado num vector de expressão e, em seguida, expresso em bactérias. A proteína é purificada por meio de três passos que envolvem a cromatografia de afinidade com metal imobilizado de iões e cromatografia de exclusão de tamanho. Dentroprincípio, é possível clonar, expressar, purificar e cristalizar proteínas em menos de quatro semanas, o que torna este protocolo um sistema rápido para analisar linhagens de norovírus emergentes.

Introduction

Noroviruses humanos são a principal causa de gastroenterite aguda em todo o mundo ^1. Estes vírus pertencem à família dos Caliciviridae, dos quais existem, pelo menos, cinco géneros, incluindo Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, e Nebovirus. Apesar de seu alto impacto no sistema de saúde e de ampla distribuição, o estudo de norovírus humanos é dificultada pela falta de um sistema de cultura celular robusto. Até à data, não existem vacinas aprovadas ou estratégias antivirais disponíveis.

A principal proteína da cãpside norovírus, denominado VP1, pode ser dividido em um domínio (s) e um invólucro (P) de domínio protuberante ^2. O domínio P é ligado ao domínio S por uma região charneira flexível (H). O domínio S forma um andaime em torno do ARN viral, enquanto que o domínio P constitui a parte mais externa da cápside viral. O domínio P monta em dímeros biologicamente relevantes quando expressos em bactérias. A P dimer interage com estruturas de carboidratos, denominados antígenos do grupo histo-sangue (HBGAs) que estão presentes como antígenos solúveis na saliva e encontra em determinadas células hospedeiras ^3. A interacção do domínio HBGA-P é pensado para ser importante para a infecção ^4. De fato, um relatório recente revelou a importância de HBGAs sintéticos ou HBGA expressando bactérias para a infecção por norovírus humana in vitro ^5.

Estudos actuais sobre a fixação das células de acolhimento de noroviruses são realizados principalmente com partículas semelhantes a vírus (VLPs) que podem ser expressas em células de insecto ou com domínios P recombinantes expressos em Escherichia coli (E. coli). Para entender as interações domínio de HBGA P em resolução atômica, estruturas complexas P domínio de HBGA pode ser resolvido usando cristalografia de raios-X. Aqui, nós descrevemos um protocolo para a expressão e purificação do domínio P que permite a produção de P no domínio em elevada quantidade e qualidade para ser utilizado para raios X Crystallography. Além disso, este método pode ser aplicado para outros domínios calicivírus P e proteínas não-estruturais.

O domínio P tem codões optimizados para E. expressão em E. coli e clonados num vector de transferência do padrão. O domínio P é então re-clonado num vector de expressão que codifica uma poli-histidina (His) tag e uma proteína de ligação a manose (MBP), que são seguidos por um local de clivagem de protease. A P-His-MBP da proteína de fusão do domínio é expressa em E. coli, seguida de três passos de purificação. A proteína de fusão do domínio MBP-His-P é purificado utilizando cromatografia de afinidade de ião metálico imobilizado (IMAC). Em seguida, a proteína de fusão é clivada com rinovírus humano (HRV) -3c protease e o domínio P é separada a partir do MBP-His por um passo adicional de purificação IMAC. Finalmente, o domínio P é purificado utilizando cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). O domínio P purificado pode então ser utilizado para a cristalografia de raios-X. Rastreio de condições de cristalização proteína é performada com kits de rastreio comercialmente disponíveis, utilizando concentrações de proteína de domínio P diferentes. crescimento de cristais é observado e as condições mais promissores são otimizados.

Com os métodos aqui descritos, é possível passar do gene para proteína a estrutura dentro de menos de quatro semanas. Portanto, o nosso método de expressão P domínio, purificação e cristalização é adequado para estudar a interação norovirus-host no nível molecular e fornecer dados importantes para auxiliar no up-to-date vacina concepção e drogas rastreio.

Protocol

1. P Domínio Clonagem Determinar a região de domínio P codificação por alinhamento de sequências de cepas de norovírus (por exemplo, a estirpe GII.10, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Além do mais, remover a região flexível na extremidade C-terminal do domínio P (Figura 2A). Codon-optimizar o ADN para E. expressão de E. coli e incluem BamHI (C-terminal) os sítios de restrição (N-terminal) e Notl, a fim de sub-clone de P o domínio regiã…

Representative Results

O esquema do protocolo descrito está representado na Figura 1. O protocolo de cobre 6 partes principais que incluem a clonagem do gene alvo, a expressão, purificação de três passos, e cristalização. A Figura 2 ilustra o desenho da construção de expressão (CE) e características do vector de expressão pMalc2x. A sequência do local de clonagem múltipla (MCS) do vector pMalc2x mostra locais de clivagem de restrição e da protease. A Fi…

Discussion

Aqui, descrevemos um protocolo para a expressão e purificação de domínios P ​​norovírus em alta qualidade e quantidade. Noroviruses não está bem estudada e os dados estruturais são continuamente necessário. Para o nosso conhecimento, a produção de domínio P usando outros protocolos (por exemplo, domínios P marcado com GST) tem sido problemática, até agora, e dados estruturais suficientes sobre a interação norovirus-host tem sido ausente. Com o método descrito aqui, que recentemente contrib…

Materials

P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 cm x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products