La producción de norovirus dominios que sobresale en humanos<em> E. coli</em> Para la cristalografía de rayos X
Summary
A continuación, se describe un método para expresar y purificar el norovirus alta calidad que sobresale dominios (P) en E. coli para su uso en estudios de cristalografía de rayos X. Este método se puede aplicar a otros dominios calicivirus P, así como las proteínas no estructurales, es decir., La proteína viral unida al genoma (VPg), proteasa, y ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp).
Abstract
La cápside norovirus se compone de una sola proteína estructural importante, denominado VP1. VP1 se subdivide en un (S) dominio shell y un dominio sobresaliente (P). El dominio S forma un andamio contigua alrededor del ARN viral, mientras que las formas de dominio P picos virales en el dominio S y contiene determinantes para la antigenicidad y las interacciones de la célula huésped. El dominio P se une estructuras de hidratos de carbono, es decir., Antígenos del grupo histo-sanguíneo, los cuales se cree que son importantes para las infecciones por norovirus. En este protocolo, se describe un método para la producción de alta calidad dominios norovirus P con altos rendimientos. Estas proteínas se pueden utilizar para la cristalografía de rayos X y ELISA con el fin de estudiar la antigenicidad y la de la célula huésped interacciones.
El dominio P se clona en primer lugar en un vector de expresión y luego se expresa en bacterias. La proteína se purificó utilizando tres pasos que implican inmovilizados cromatografía de afinidad de iones metálicos y cromatografía de exclusión por tamaño. Enprincipio, es posible clonar, expresar, purificar y cristalizar proteínas en menos de cuatro semanas, lo que hace este protocolo un sistema rápido para el análisis de las cepas de norovirus de reciente aparición.
Introduction
Norovirus humanos son la principal causa de gastroenteritis aguda en todo el mundo 1. Estos virus pertenecen a la familia Caliciviridae, de los cuales hay al menos cinco géneros, incluyendo norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, y Nebovirus. A pesar de su alto impacto en el sistema de salud y la distribución amplia, el estudio de los norovirus humanos se ve obstaculizada por la falta de un sistema de cultivo celular robusto. Hasta la fecha, no existen vacunas aprobadas o estrategias antivirales disponibles.
La principal proteína de la cápside norovirus, denominado VP1, se puede dividir en un (S) dominio shell y un (P) que sobresale de dominio 2. El dominio P está conectado al dominio S por una región bisagra flexible (H). El dominio S forma un andamio alrededor del RNA viral, mientras que el dominio P forma la parte más exterior de la cápside viral. El dominio P se ensambla en dímeros biológicamente relevantes cuando se expresa en bacterias. El Pdimer interactúa con estructuras de hidratos de carbono, denominados antígenos del grupo histo-sangre (HBGAs) que están presentes como antígenos solubles en la saliva y que se encuentra en ciertas células huésped 3. El dominio de interacción-HBGA P se piensa que es importante para la infección 4. De hecho, un informe reciente reveló la importancia de HBGAs sintéticas o HBGA-expresión de bacterias para la infección por norovirus humana in vitro 5.
Los estudios actuales con respecto a la unión de las células huésped de norovirus se realizan principalmente con partículas similares a virus (VLP) que se pueden expresar en células de insectos o con dominios P recombinantes expresados en Escherichia coli (E. coli). Para entender las interacciones de dominio-HBGA P a resolución atómica, estructuras complejas P dominio-HBGA se pueden resolver utilizando cristalografía de rayos X. Aquí, se describe un protocolo para la expresión de dominio P y purificación que permite la producción de dominio P en gran cantidad y de la calidad que se utilizará para crystall de rayos Xgrafía. Por otra parte, este método se puede aplicar para otros dominios calicivirus P y las proteínas no estructurales.
El dominio P está optimizado codón para E. expresión coli y se clonó en un vector de transferencia estándar. El dominio P se vuelve a clonar en un vector de expresión que codifica una polihistidina etiqueta (His) y una proteína de unión a manosa (MBP) que son seguidos por un sitio de escisión de la proteasa. El Su–P MBP proteína de fusión de dominio se expresa en E. coli, seguido por tres etapas de purificación. La proteína de fusión de dominio MBP-His-P se purificó usando cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC). A continuación, la proteína de fusión se escinde con rinovirus humano (HRV) proteasa -3C y el dominio P se separa de la MBP-His por una etapa adicional de purificación IMAC. Por último, el dominio P se purificó usando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). El dominio P purificada se puede usar entonces para la cristalografía de rayos X. La selección de las condiciones de cristalización de proteínas es performó con los kits de detección disponibles comercialmente utilizando diferentes concentraciones de proteína de dominio P. El crecimiento de cristales se observa y se optimizan las condiciones más prometedores.
Con los métodos descritos aquí, es posible pasar de gen a la proteína a la estructura en menos de cuatro semanas. Por lo tanto, nuestro método de expresión P dominio, purificación y cristalización es adecuado para estudiar la interacción norovirus huésped a nivel molecular y proporcionar datos importantes para ayudar en la detección de diseño y de drogas hasta a la fecha de la vacuna.
Protocol
Representative Results
Discussion
A continuación, se describe un protocolo para la expresión y purificación de dominios P norovirus en alta calidad y en cantidad. Los norovirus no están bien estudiadas y son continuamente necesitan datos estructurales. A nuestro entender, la producción de dominio P utilizando otros protocolos (por ejemplo, dominios GST-etiquetados P) ha sido problemático, hasta el momento, y suficientes datos estructurales sobre la interacción huésped norovirus se han perdido. Con el método descrito aquí, hemos …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.
Materials
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 cm x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
Referências
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).
- Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
- Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
- Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
- Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
- Mccoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
- Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
- Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses’ fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
- Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).
