تحويل جينية كطريقة آمنة وبسيطة للحصول على خلايا إفراز الأنسولين من الخلايا الليفية الجلد الكبار
Summary
Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.
Abstract
Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.
Introduction
والهدف الأساسي من الطب التجديدي هو توليد خلايا جديدة والفنية التي يمكن أن تستخدم لإصلاح أو استبدال التالفة، تحولت الأنسجة. اعادة تشكيل خلايا بالغة متاحة بسهولة في جديدة، وتحويلها من نوع خلية واحدة إلى أخرى، هو نهج جذابة بشكل خاص، خصوصا عندما يكون السكان الخلية المطلوبة ليست وفيرة أو صعوبة الوصول إليها. ومع ذلك، خلايا بالغة مستقرة بشكل ملحوظ. يكتسبون دولتهم متباينة من خلال تقييد تدريجي في خياراتها، وبمجرد وصولها إلى التخصص محطة ناضجة، فإنها مستقر الاحتفاظ بها 1.
في السنوات الأخيرة تم وضع عدد من البروتوكولات، التي تمكن من إعادة برمجة لتعدد القدرات من خلية جسدية (آي بي إس) تحققت من خلال التعبير القسري لمجموعة من النسخ عوامل 2،3. بدلا من ذلك، تحويل الخلايا يمكن الحصول عليها عن طريق transdifferentiation النسب المباشر، وإدخال واحد 4 </su ص> أو مزيج من النسخ عوامل 5-7. لا تنطوي هذه الاستراتيجية الانتقال من خلال دولة متباينة دي ولكن يتطلب التعبير عالية من النسخ محددة عوامل 8.
لقد وضعت مؤخرا على بروتوكول التحويل على أساس التعرض قصيرة من الخلايا البالغة إلى خصائص demethylating من سيتيدين التناظرية 5 آزاسيتيدين (5-عزة-CR)، وتتميز بشكل جيد المانع الحمض النووي ناقلة الميثيل. ويتبع الخطوة نزع الميثيل على الفور من قبل بروتوكول التمايز محددة 11/9 التي تسمح للحصول على النمط الظاهري المحطة المطلوبة. هذا الأسلوب هو قادرة على تحويل ناضجة، وخلايا متباينة في الخلايا من سلالة مختلفة ولديه ميزة كبيرة لتجنب كل من استخدام ناقلات فيروسية وترنسفكأيشن من أي عوامل النسخ الخارجية. وتجنب أيضا الاستحواذ على الدولة المحفزة مستقرة، والمتعلقة زيادة القابلية للخلية عدم الاستقرار.
<p class="jove_content"> بروتوكول مفصل يسمح للتحويل الخلايا الليفية الجلد البشري الكبار في الخلايا المفرزة للأنسولين تعمل بكامل طاقتها ويرد هنا. ومع ذلك، فمن الجدير بالذكر أن هذه التقنية تم تطبيقها على أنواع مختلفة من الخلايا، ولدت نتائج إيجابية، عند معالجة الخلايا تجاه مختلف مسارات التمايز. وعلاوة على ذلك، تم استخدام تحويل جينية بنجاح في الجنس البشري والخنازير 13/09 وكذلك في الكلب (مخطوطة المقدمة) مما يدل على فعالية واسعة ومتانة هذا النهج.Protocol
Representative Results
Discussion
يصف المخطوطة الحالية الأسلوب الذي يسمح للتحويل الخلايا الليفية الجلد البشري إلى خلايا منتجة للأنسولين، من خلال التعرض عابرة وموجزة ل5-عزة-CR، تليها بروتوكول تحريض محددة الأنسجة. هذا النهج يتيح التحول من الأديم المتوسط إلى خلايا ذات الصلة الأديم، من دون التعبير ال…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة Carraresi والمؤسسة الأوروبية لدراسة مرض السكري (EFSD). ويدعم GP من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من جامعة ميلانو. المؤلفون هم أعضاء في عمل التكلفة FA1201 Epiconcept: علم التخلق وPericonception البيئة والعمل تكلفة BM1308 مشاركة السلف على نماذج حيوانية كبيرة (SALAAM). TALB عضو في العمل تكلفة الأحياء CM1406 جينية الكيميائية (EPICHEM).
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
Referências
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
- Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
- Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
- Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
- Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained?. Development. 134 (4), 635-646 (2007).
- Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).
