Conversão epigenética como um método seguro e simples para obter células secretoras de insulina a partir de fibroblastos da pele de adultos
Summary
Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.
Abstract
Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.
Introduction
Um dos objectivos fundamentais da medicina regenerativa é a geração de células novas e funcionais que podem ser utilizadas para reparar ou substituir danificado, degenerou tecidos. Refazendo células adultas facilmente disponíveis para novos, convertendo-os a partir de um tipo de célula para outra, constitui uma abordagem particularmente interessantes, especialmente quando a população de células não é necessário abundante ou de difícil acesso. No entanto, células adultas são notavelmente estáveis. Eles adquirem seu estado diferenciado através de uma restrição gradual em suas opções e, uma vez que eles atinjam a especialização de terminais maduros, eles estavelmente guarde-1.
Nos últimos anos, um número de protocolos têm sido desenvolvidos, que permitem a reprogramação para pluripotência de uma célula somática (IPS) obtida através da expressão forçada de um conjunto de factores de transcrição 2,3. Alternativamente, a conversão de células podem ser obtidas por transdiferenciação linhagem directa, a introdução de um único quatro </sup> ou uma combinação de factores de transcrição 5-7. Esta estratégia não envolve a transição através de um estado diferenciado-de, mas exige alta expressão da transcrição específica fatores 8.
Nós desenvolvemos recentemente um protocolo de conversão com base na breve exposição de células adultas para as propriedades demetilantes da citidina análogo 5-azacitidina (5-aza-CR), um inibidor da DNA metiltransferase bem caracterizado. O passo de desmetilação é imediatamente seguido por um protocolo de diferenciação específica 9-11 que permite obter o fenótipo do terminal necessária. Este método é capaz de converter as células maduras, diferenciadas em células de uma linhagem diferente e tem a vantagem substancial a fim de evitar, tanto a utilização de vectores virais e a transfecção de quaisquer factores de transcrição exógenos. A aquisição de um estado pluripotente estável, eo aumento da susceptibilidade relacionadas à célula instabilidade também é evitado.
<p class="Jove_content"> O protocolo detalhado que permite a conversão de fibroblastos da pele de seres humanos adultos em células totalmente funcionais secretoras de insulina é aqui apresentada. No entanto, é importante notar que a técnica tem sido aplicada a diferentes tipos de células e produziu resultados positivos, ao abordar células no sentido de várias vias de diferenciação. Além disso, a conversão epigenética tem sido utilizado com sucesso na espécie humana e suína 9-13, bem como no cão (manuscrito apresentado), sugerindo uma grande eficácia e robustez da abordagem.Protocol
Representative Results
Discussion
O presente manuscrito descreve um método que permite a conversão de fibroblastos de pele humana em células produtoras de insulina, por meio de uma exposição transitória e breve a 5-aza-CR, seguido por um protocolo de indução de tecido específico. Esta abordagem permite que um interruptor de mesoderme endoderme de células relacionadas, sem a expressão forçada de factores de transcrição ou microARNs nem a aquisição de um estado pluripotente estável, que torna as células mais instável e propenso a erros …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação Carraresi e Fundação Europeia para o Estudo da Diabetes (EFSD). GP é apoiado por uma bolsa de pós-doc, da Universidade de Milão. Os autores são membros da Acção COST FA1201 Epiconcept: Epigenética e Periconception ambiente e da Acção COST BM1308 Sharing avança em modelos animais de grande porte (SALAAM). Talb é membro da Acção COST CM1406 epigenética Chemical Biology (EPICHEM).
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
Referências
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