Conversão epigenética como um método seguro e simples para obter células secretoras de insulina a partir de fibroblastos da pele de adultos

Resumo

Aqui, é apresentado um novo método que permite a conversão de fibroblastos da pele adulta em células secretoras de insulina. Esta técnica é baseada na conversão epigenética, não envolve o uso de vetores retrovirais nem a aquisição de um estado pluripotente estável. É, portanto, altamente promissor para aplicações em medicina translacional.

Resumo

A medicina regenerativa requer células novas e totalmente funcionais que são entregues aos pacientes para reparar tecidos degenerados ou danificados. Quando tais células não estão prontamente disponíveis, elas podem ser obtidas usando diferentes abordagens que incluem, entre muitas, reprogramação e transdiferenciação, com vantagens e limitações específicas das diferentes técnicas. Aqui, uma nova estratégia para a conversão de um fibroblasto adulto maduro em uma célula secretora de insulina, arbitrariamente designada como células convertidas epigenéticas (EpiCC), é descrita. O método foi desenvolvido, com base na crescente compreensão dos mecanismos que controlam a regulação epigenética do destino e diferenciação celular. Em particular, o primeiro passo usa um modificador epigenético, ou seja, 5-aza-citidina, para levar as células adultas a um estado "altamente permissivo". Em seguida, aproveita essa janela breve e reversível de plasticidade epigenética para redirecionar as células para uma linhagem diferente. A abordagem é designada "conversão celular epigenética". É uma maneira simples e robusta de obter um interruptor de interlinhagem celular eficiente, controlado e estável. Como o protocolo não envolve o uso de nenhuma transfecção de genes, é livre de vetores virais e não envolve um estado pluripotente estável, é altamente promissor para aplicações em medicina translacional.

Introdução

Um dos objectivos fundamentais da medicina regenerativa é a geração de células novas e funcionais que podem ser utilizadas para reparar ou substituir danificado, degenerou tecidos. Refazendo células adultas facilmente disponíveis para novos, convertendo-os a partir de um tipo de célula para outra, constitui uma abordagem particularmente interessantes, especialmente quando a população de células não é necessário abundante ou de difícil acesso. No entanto, células adultas são notavelmente estáveis. Eles adquirem seu estado diferenciado através de uma restrição gradual em suas opções e, uma vez que eles atinjam a especialização de terminais maduros, eles estavelmente

Protocolo

Nota: Todos os procedimentos descritos abaixo deve ser realizada sob capela de fluxo laminar em condições estéreis. Certifique-se de que todos os procedimentos de cultura são realizadas em etapas termóstato e as células são mantidas a 37 ° C em toda a manipulação.

1. Pele Isolamento de fibroblastos

1. Prepare Cultura Solution Dish Coating
   1. Dissolve-se 0,1 g de gelatina porcina em 100 ml de água (concentração final 0,1%). Esterilizar solução com autoclave.
   2. Adicionar 1,5 ml de solução estéril de gelatina porcina 0,1% a 35 mm pratos Petri. Espera 2 h para o revestimento, mantendo-as à temperatura ambiente.
      Nota: As biópsias da pe....

Resultados

Estabelecimento de cultura primária a partir de biópsias de pele
As biópsias da pele foram cortados em pequenos fragmentos e colocados em pratos de gelatina pré-revestidos. Após 6 dias, os fibroblastos começou a crescer a partir dos fragmentos de tecido e formou uma monocamada de células (Figura 1A). As células apresentaram uma forma típica alongado e, como esperado, apresentou um imuno-positividade uniforme para o fibroblasto vimentina marcador específico (VIM, <.......

Discussão

O presente manuscrito descreve um método que permite a conversão de fibroblastos de pele humana em células produtoras de insulina, por meio de uma exposição transitória e breve a 5-aza-CR, seguido por um protocolo de indução de tecido específico. Esta abordagem permite que um interruptor de mesoderme endoderme de células relacionadas, sem a expressão forçada de factores de transcrição ou microARNs nem a aquisição de um estado pluripotente estável, que torna as células mais instável e propenso a erros ^14.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina tamponada com fosfato Dulbecco	Sigma	D5652	PBS; para lavagem de células e preparação de solução
Solução antibiótica antibiótica	Sigma	A5955	Componente de fibroblastos, HP e meios pancreáticos
Placa de Petri de 100 mm	Sarstedt	83.3902	Para isolamento de fibroblastos
Gelatina suína	Sigma	G1890	Para revestimento de pratos
Água	Sigma	W3500	Para preparação de solução
35 mm Placas de Petri	Sarstedt	83.39	Para isolamento de fibroblastos
DMEM, glicose alta, piruvato	Life Technologies	41966052	Para meio de cultura de fibroblastos
Soro bovino fetal	Life Technologies	10500064	FBS; Componente de fibroblastos e meios HP
Solução de L-glutamina	Sigma	G7513	Componente de fibroblastos, HP e meios pancreáticos
Solução de tripsina-EDTA	Sigma	T3924	Para dissociação de fibroblastos
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 COM GRADES	Hycor Biomedical	87144	Contagem de células
5-Azacitidina	Sigma	A2385	5-aza-CR, para células increrase plasticidade em fibroblastos
Mistura de nutrientes F-10 da Ham's	Life	Technologies 31550031	Para meio HP
DMEM, baixa glicose, piruvato	Life Technologies	31885023	Para HP médio
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828028	Componente do meio HP
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais	Life	11140035	Componente de HP e meio basal pancreático
2-mercaptoetanol	Sigma	M7522	Componente de HP e meio basal pancreático
Guanosina	Sigma	G6264	Componente de estoque de mistura de nucleosídeos do meio HP
Adenosina	Sigma	A4036	Componente de estoque de mistura de nucleosídeos do meio HP
Citidina	Sigma	C4654	Componente de estoque de mistura de nucleosídeos do meio HP
Uridina	Sigma	U3003	Componente de estoque de mistura de nucleosídeos do meio HP
Timidina	Sigma	T1895	Componente de estoque de mistura de nucleosídeos do meio HP
Millex-GS 0,22 µ m	Millipore	SLGS033SB	Para esterilização da solução
FGF-Basic (AA 1-155) Tecnologias de Vida de Proteína Humana Recombinante		PHG0261	bFGF; Componente de HP e meio basal pancreático
Albumina de soro bovino	Sigma	A3311	BSA; Componente do meio basal pancreático
DMEM / F-12	Life Technologies	11320074	para meio basal pancreático
B-27 Suplemento menos vitamina A	Life Technologies	12587010	componente do meio pancreático
N-2 Suplemento	Life Technologies	17502048	do meio basal pancreático
Activin A Proteína humana recombinante	Life Technologies	PHG9014	Para meio pancreático
Ácido Retinóico	Sigma	R2625	Para meio pancreático
Dimetil sulfóxido Sigma		D2650	DMSO; para preparação de estoque de ácido retinóico
Insulina-Transferrina-Selênio	Life Technologies	41400045	ITS; para meio Pancreático Final
Anticorpo anti-Vimentina	Abcam	ab8069	Para análise imunocitoquímica. Diluição de trabalho 1:100
4′,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato	Sigma	32670	DAPI. Para análise imunocitoquímica. Diluição de trabalho  1 µ g/ml
5-Metilcitidina	Eurogentec	MMS-900P-B	Para análise imunocitoquímica. Diluição de trabalho 1:500
Anti-C Peptídeo anticorpo	Abcam	ab14181	Para análise imunocitoquímica. Diluição de trabalho 1:100
Anti-PDX1 anticorpo	Abcam	ab47267	Para análise imunocitoquímica. Diluição de trabalho 1:500
Mercodia Insulina ELISA	Mercodia	10-1113-10	Para detecção de liberação de insulina

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