Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake

Published: May 21, 2016 doi: 10.3791/53914
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,4
1Auditory Neuroscience Laboratory, Institute of Neuroscience of Castilla y León, University of Salamanca, 2Neural Systems Laboratory, Institute for Systems Research, University of Maryland, 3Medical Research Council Institute of Hearing Research, 4Department of Cell Biology and Pathology, Faculty of Medicine, University of Salamanca

Abstract

הבדלים בפעילות של נוירוטרנסמיטורים neuromodulators, וכתוצאה מכך תגובות עצביות שונות, ניתן למצוא בין בעלי חיים הרדימו ו ​​ערים. לכן, שיטות המאפשרות המניפולציה של מערכות הסינפטי בחיות ערות נדרשות על מנת לקבוע את התרומה של תשומות הסינפטי עיבוד עצבי מושפע הרדמה. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה לבניית אלקטרודות להקליט פעילות עצבית תאית זמנית ולשחרר חומרי neuroactive מרובים בבת בקרבת אתרי ההקלטה בעכברים ערים. על ידי שילוב של נהלים אלה, ביצענו זריקות microiontophoretic של gabazine לחסום קולטני גאבא סלקטיבי בנוירונים של colliculus הנחות של עכברים-מרוסנת הראש. Gabazine בהצלחה שונה מאפייני תגובה עצביים כמו אזור תגובת התדר והתאמת גירוי ספציפי. לפיכך, אנו מראים כי השיטות שלנו מתאימות recording פעילות יחידה אחת ועבור לנתח את התפקיד של קולטנים ספציפיים הנוירוטרנסמיטר עיבוד שמיעתי.

המגבלה העיקרית של ההליך המתואר הוא זמן ההקלטה קצר יחסית (~ 3 שעות), אשר נקבע על ידי רמת הרגלה של החיה כדי ההקלטות. מצד השני, הקלטות מרובות יכולות להתבצע באותו החיה. היתרון של שיטה זו על פני פרוצדורות אחרות להשתמש כדי לתפעל את הרמה עצבית או neuromodulation (כגון זריקות מערכתיות או שימוש במודלי optogenetic), הוא כי השפעת התרופה מוגבלת לכניסות הסינפטי המקומיות הנוירון היעד. בנוסף, את הייצור וההרכבה של האלקטרודות מאפשר התאמה של פרמטרים ספציפיים בהתאם למבנה העצבי וסוג נוירון עניין (כגון ההתנגדות טיפ לשיפור יחס אות לרעש של ההקלטות).

Introduction

משחק הגומלין של עירור עצבי ועיכוב חיוני עבור עיבוד מידע חושי 1. זה ידוע גם כי יש הרדמת השפעה חזקה על הדינמיקה של הפעלת קליפת מוח ואת התבנית הזמנית של תשומות הסינפטי 2,3. לדוגמה, היא נצפתה כי הרדמה לשנות את משך תגובות חזותית עוררו נוירונים בקליפת המוח 3,4. יתר על כן, היחס בין מעוררים ותשומות הסינפטי מעכבות שונה בבעלי חיים הרדימו ערים 4,5, שינוי הן עורר ושיעורי פעילות ספונטניים 6,7. באמצעות מדידת conductances הסינפטי, היידר ועמיתיו 4 מצאו כי עירור מתאים עיכוב משרעת בהרדמה ואילו בשעות הערות, העיכוב היה חזק יותר עירור. ממצאים אלה מעוררים את הפיתוח של פרוצדורות כדי לחקור את ההשפעה של תשומות הסינפטי ספציפיות על עיבוד חושי בחיות ערות.

<p class = "jove_content"> הפליטה המבוקרת של חומרי neuroactive שגובים החלת זריקות נוכחיות קטנות (בסדר גודל של Na) כבר נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד את התרומה של תשומות הסינפטי ואת תפקידיו של קולטני תא משוער בעיבוד חושי 8-13 . טכניקה זו, המכונית microiontophoresis, ומאפשרת נקיטת תרופות בקרבת הנוירון המוקלט, אשר תורם השפעה מהירה ומרותקת. הליך זה מתאים יותר ללימוד השפעות מקומיות של חומרי neuroactive, לעומת ההשפעה הנרחבת שהושרה על ידי מניפולציות ניסיוני אחרות כגון זריקות מערכתיות, microdialysis או שימוש בטכניקות optogenetic. בדרך כלל, תצורת האלקטרודה פיגי בחזרה 14,15 משמשת להקלטת הנוירון המטרה השונה בו זמנית ולספק חומרי neuroactive העניין. הוא מורכב אלקטרודה הקלטה מחוברת פיפטה multibarrel שנושאת החומרים neuroactive. שינויים של oהליך riginal שתיאר הייבי ו Caspary 14 יושמו. לדוגמה, אלקטרודה טונגסטן, במקום כוס אחת, שניתן להשתמש בהם כדי להקליט את הפעילות העצבית 16. בעבר שיטות שפורסמו לייצור אלקטרודות טונגסטן 17,18 לערב שלושה שלבים כלליים: תחריט אלקטרוליטי של טיפי תיל טונגסטן, בידוד זכוכית, וכוונון חשיפת העצה כדי לעמוד בדרישות הקלטה.

תחום מעניין ו מתהווה במדעי המוח השמיעתי הוא חקר הסתגלות לגירוי ספציפי (SSA 19). SSA הנה קיטון ספציפי התגובה העצבית לצלילים חוזרים שאינו להכליל אחרים, צלילים מוצגים לעתים רחוקות. חשיבותה של SSA מתגוררת התפקיד הפוטנציאלי שלה בתור זיהוי סטייה בסיסית מנגנון עצבי במוח השמיעה, וכן לתאם עצבי אפשרי עבור הרכיב שלילי התאמה המאוחרת של השמיעה עוררת 20,21 פוטנציאליים. SSA occurs מן IC עד קליפת המוח השמיעתית 19,22-24. GABA A עיכוב בתיווך הודגם לפעול כמנגנון בקרת שבח על SSA 7,16,25, אשר גם הוכח להיות מושפעת 26 הרדמה. כאן אנו מציגים פרוטוקול משלבת שיטות שתוארו קודם לכן להקלטת הפעילות-היחידה האחת של נוירונים IC לפני ובמהלך היישום של אנטגוניסט סלקטיבי של -receptors GABA A בעכברים ערים. ראשית, אנו מתארים לייצור אלקטרודות גב פיגי וליד, שיטות כירורגיות הקלטה. כדי לבדוק את היעילות של שחרור תרופה, השווינו את השדה הפתוח כמו גם רמת SSA של נוירונים IC לפני ובמהלך פליטת microiontophoretic של gabazine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוצדורות בוצעו באוניברסיטת סלמנקה באישור, ושימוש בשיטות העומדות בסטנדרטים של, אוניברסיטת ועדת טיפול סלמנקה בעלי חיים כמו גם את הסטנדרטים של האיחוד האירופי (Directive 2010/63 / EU) עבור השימוש בבעלי חיים למחקר מדעי המוח.

1. אלקטרודות טונגסטן

הערה: ייצור של אלקטרודות טונגסטן מבוסס על הטכניקה המקורית המתואר מריל איינסוורת 27 ו איינסוורת ואח 28 וביצע באמצעות הגדרת תחנת העבודה המתוארת בולוק ואח 17...

  1. כדי לתעד את פעילות חוץ-תאי יחידה אחת של נוירונים IC, השתמש אלקטרודות עם עכבת קצה של 1.5 - 2.5 MΩ. הנה, את הצעדים הכרוכים בייצור טונגסטן אלקטרודה מתוארים רק בקצרה, מאז תיאור מפורט נמצא אזכור הנ"ל.
  2. מניחים חוטי טונגסטן בתוך יישור שהותקןהכלי (איור 1 א) כדי לסייע חיתוכם באורך הרצוי. כלי היישור מורכב 30 מחטים (25 G) מודבקות במקביל ב 2 מ"מימ במרווחים, עם עצירה בקצה אחד כדי להגביל את אורך החוטים ל ~ 40 מ"מ. בזהירות לצרף את הקצוות החופשיים של חוטים עם סרט דביק, וחותכים את שארית החוט במספריים חזק.
  3. משוך בעדינות את הקלטת כדי להסיר את חוטי טונגסטן מכלי היישור, ולוודא כי כל החוטים נשארים צמודים לקלטת. מרדד את הסרטים על ציר פליז מלוטש (איור 1 ב ', ג'), מחזיק את החוטים בתקיפות נגד הציר ולכן יש חיבור חשמל טוב.
  4. חבר את הציר כדי מנוע 5 סל"ד ב תחנת העבודה, לטבול את קצות חוט הבולטים לתוך פתרון תחריט (KNO 2, 90 גרם לכל 80 מיליליטר). זווית ציר ציר 45 ° ביחס אל פני השטח של פתרון התחריט. לטבול את קצות חוט כך ~ 1/3 של החוטים לפנות הפתרון.
  5. IMMerse אלקטרודה מוט הפחמן לאמבטיה תחריט כדי לסגור את המעגל. השתמש במברשת צמת נחושת אביב להחיל את אספקת התחריט אל פיר הציר בעודך הציר מסתובב. התאם את הזרם עובר דרך אלקטרודות והפתרון תחריט 250 מילי-אמפר. עצור את תחריט עצה כאשר הזרם יורד ל -200 מילי-אמפר. עצות החוט תהיינה חקוקות לנקודות מאוד בסדר.
  6. לעבור חוט אחד חדד באמצעות להבה כדי להסיר שאריות שומן דבקים. מניחים את חוט (בקצה הקהה הראשון) לתוך נימי זכוכית בורוסיליקט (OD 1.5 מ"מ, 0.86 מ"מ ID) עם הקצה התחתון שלה חסום עם פלסטלינה. הצמד את פיפטה אנכית בחלק העליון והתחתון. משוך את פיפטה באמצעות סליל חימום (בקוטר של 5 מ"מ, מ"מ עומק 5) ו בוכנה מושעה. ככל שהחוט הוא הרוס בגלל המשקל של הבוכנה, זכוכית מותכת טפסים מעיל יפה מאוד סביבו.
  7. הסר את הזכוכית המכסה את הקצה בסוף החדה של האלקטרודה בעזרת חרוז מותך של נתרןtetraborate. כדי ליצור את החרוז, לערבב את tetraborate נתרן (~ 0.25 גר ') עם כמות קטנה של מים (~ 0.5 מיליליטר) ולאט לאט והנח אותו על גוף חימום, עד שהוא נמס לתוך חרוז ~ 2 מ"מ קוטר. הטמפרטורה של גוף החימום נשלטת על ידי פוטנציומטר. מניח את חרוז גוף חימום על זרוע מניפולטור הקבועה לשולחן, והעבר אותו עד החרוז מתמקד מתחת למיקרוסקופ בהגדלה נמוכה.
  8. אבטח את החוט-מכוסה זכוכית לשקופית ולמקם אותו תחת המיקרוסקופ. להעביר את השקף עם ידיות הבמה עד קצה חרוז tetraborate הם בפוקוס. מחמם את החרוז עד שהוא נמס מעט, והכנס את קצה החוט ~ 10 - 15 מיקרומטר. סובבו את פוטנציומטר חימום מעל. כמו החרוז מתקרר, הוא מתכווץ ויסיר את הזכוכית מהקצה האלקטרודה, חשיפת טונגסטן הבסיסית. אלקטרודה טונגסטן מוכנה לשימוש.

2. ייצור Multibarrel זכוכית פיפטה

  1. הגנו על הקצוות של רבנימים לחבית זכוכית (חמש חביות H-תצורה) עם צינורות חומים להתכווץ, כדי לאפשר אחיזה טובה יותר על מלחציים חולץ ולמנוע שבירה, ומקום אחד חולץ האנכי.
  2. כדי להשיג באורכי קצה ~ 15 מ"מ, להגדיר את חולץ הפרמטרים הבאים: חום: 84, כוח מגנט משנה: 49, כוח מגנט ראשי: 38. שפר פרמטרים אלה על פי תצורה המסוימת, כמו גם לאחר השינוי גוף חימום.
  3. משוך את נימי לקבלת שתי טפטפות בקצות האפילו. הר פיפטה בשקופית באמצעות פלסטלינה ולשבור את קצה פיפטה תחת מיקרוסקופ עד הקוטר החיצוני הוא ~ 20 - 30 מיקרומטר, באמצעות מספריים או מלקחיים בסדר, או את הצד השטוח של סכין מנתחים. אם הקצה השבור גס מדי, לעדן אותו באמצעות טכניקת חרוז tetraborate שמתוארת בשלב 1.7.
  4. מניחים אלקטרודה טונגסטן (מסעיף 1) בבעל עשה עם מחט 20 G בסוף של micropositioner מיניאטורי 3 ציר רכוב על צבי מיקרוסקופדואר. בעזרת מלקחיים, תכופף את קצהו של האלקטרודה 5 - 10 °, ~ 30 מ"מ מהקצה.
  5. מתחת למיקרוסקופ, ליישר את אלקטרודת טונגסטן בזהירות מעל קצה multibarrel. לאחר המיושר, מנמיך את האלקטרודה עד מגעים multibarrel, להשתלב החריץ בין שתי החביות העליונות. החלק את קצה האלקטרודה עד שבולט ~ 15 - 20 מיקרומטר הרחק קצה multibarrel. הפוך את הזווית בין האלקטרודה multibarrel הקטן ככל האפשר כדי להשיג מליטה טובה יותר אנסמבל רזה.
  6. החל טיפה קטנה של דבק אור לריפוי ~ 5 מ"מ מן העצות. היזהר הדבק לא להגיע עצה כדי למנוע חסימת ערוצי multibarrel.
  7. לרפא את הדבק באמצעות מנורת LED כחול בהיר. חזור על היישום הדבק / ריפוי במידת צורך, עבור מליטה טובה יותר.
  8. הזז את הבמה מיקרוסקופ בעדינות עד סוף אלקטרודה טונגסטן הוא שוחרר מהבית למחזיק בו. הסר את הרכב פיגי גב משקופית.
  9. גלישת הדואר החלק האמצעי של האלקטרודה גב חזירון ב אורך קצר של כיווץ בחום צינור ולהחיל המתאים אפוקסי ריפוי מהיר לזכוכית כדי להמשיך לאבטח את אלקטרודת טונגסטן אל multibarrel.

3. תרופות Microiontophoresis

הערה: התרופות המשמשות עבור microiontophoresis חייבות להיות בעל מטען חשמלי כאשר מומסים במים. בדוק את הספרות כדי לראות אם תרופת העניין מתאימה הליך זה. הנה, את הליך gabazine, אנטגוניסט של קולטן גאבא, מתואר.

  1. מסנן מים מזוקקים באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר לעקר במים ולאבטח המכיל לא מומס. הכן ~ 1,000 μl של 20 מ"מ gabazine באמצעות מים מזוקקים זה.
  2. התאם את ה- pH של דילול עד 4 עם 0.2 מיקרומטר NaOH מסונן באמצעות אלקטרודה pH בסדר-קצה.
  3. אחסן 100 - 200 aliquots μl ב -20 ºC. הפשיר ביום ההקלטה. באותו היום, לפני שבעל החיים הם לרסןed, למלא את חביות (3 - 5 μl) של האלקטרודה multibarrel עם הסמים, באמצעות microsyringe 100 μl מצויד במחט פלסטיק גמיש.

כירורגיה 4. השרשה Headpost

  1. בצע ניסויים בשני עכברים זכרים CBA / J (musculus Mus) עם משקולות של גרם 27 ו -30. בצע ניתוחים הקלטה של בראיינט ועמיתיו 29, Portfors ומשתפי הפעולה 30-32, ו Duque ו Malmierca 26.
  2. בימים לפני הניתוח, לטפל בחיות להרגיל אותם לתא ההקלטה בכך שהוא מאפשר להם לחקור בחופשיות. בצע 3 הפעלות ליום, כל אחד שנמשך לפחות 30 דקות. בדרך זו החיות תהיינה רגועות ונוחה במהלך ההקלטות.
  3. להרדים את העכבר באמצעות שילוב של קטמין (50 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) מוזרק לשריר. עם מינון זה שהחיה היא בהרדמה עמוקה כ 1 שעה. לתת מינונים משלימים של thir אחדד של המינון הראשוני לפי הצורך.
  4. מניח את החיה על שמיכת חימום להגדיר כדי לשמור על טמפרטורה של 38 ± 1 ºC ולייצב את ראשו של בעל החיים בתוך מסגרת stereotaxic באמצעות שני ברי אוזן בר לנשוך. היזהר שלא לנקב את עור התוף עם ברי אוזניים.
  5. להגן על העיניים באמצעות החלת טיפת ג'ל עיניים.
  6. לגלח את הקרקפת בעזרת מספריים ולהחיל-יוד povidone לחטא את העור.
  7. באמצעות אזמל, עושה חתך לאורך קו האמצע לחשוף את הגולגולת לחזור בו periosteum המכסה את הקודקודית ואת החלק מקורי יותר של העצמות העורפיות.
  8. דבק headpost duralumin קל (משקל ~ 0.65 גרם, אורך 30 מ"מ, איור 2 א) עם סיבוב ובסיס שטוח (5 מ"מ קוטר) על הגולגולת. מדביקים חוט כסף כדי באמצע headpost עוזב הקצוות שלה בחינם. חוט הכסף ישמש האלקטרודה התייחסות הקלטת אלקטרו.
  9. למרוח שכבה דקה של ligדבק HT-לריפוי על הגולגולת בבסיס headpost. מתן 10 שניות ומניחים את headpost מעל האזור המקורי של העצמות הקודקודית, לאורך קו האמצע.
  10. לקבלת כוח מליטה יעילה, אור לרפא את הדבק באמצעות מקור אור כחול במשך 20 שניות.
  11. מקדחה שלושה חורים סביב ומאחורי בבסיס headpost באמצעות מקדחה חשמלית וקצת תרגיל קטן.
  12. מניח שני ברגי שעון (~ 2 מ"מ אורך) של חורים שנקדחו לשרת נקודות מגע נוספות כמו בין הגולגולת לבין headstage. בורגי דורשים ½ 1 פונה להשיג להתפרק בכושר. בדוק את הברגים עם מלקחיים כדי לוודא שהם אינם רופפים.
  13. הכנס את קצה חוט קרקע הכסף לתוך החור השלישי ביצירת קשר, זה בטוח הדור. החל טיפה קטנה של דבק cyanoacrylate עמיד במים לקשור את החוט אל הגולגולת.
  14. החל מרוכבי ריפוי אור נועד לחזק את הקשר של headpost עם הגולגולת. מכסה את הבסיס של headpost, החלק הנמוך של חוט הכסף,ואת הברגים, נזהרים שלא להאריך מאחורי למבדה, כדי לאפשר גישה במהלך ההקלטה. לרפא באמצעות מקור אור כחול.
  15. לחזור בו שריר בחלק האחורי של הצוואר ליד והחדרתו על הגולגולת. באמצעות מקדחה קטנה (2.35 מ"מ קוטר), לקדוח חלון עגול ממש מתחת תפר למבדה ו לרוחב קו האמצע, כדי לחשוף את colliculus הנחה (IC). כאשר הגבולות רופפים, למשוך את עצם הכיסוי עם פינצטה בסדר. אם הדימום מתרחש, לשטוף עם מי מלח סטרילית קר כדי לעצור את זה.
  16. הפוך קטן (~ 1 מ"מ רחב ~ 1 מ"מ גבוה) חומה סביב החלון עם ריפוי באמצעות האור מורכב וזה.
  17. מכסה את גולגולת שריר החשופים עם משחה אנטיביוטית. לאחר מכן, להרטיב את השטח החיצוני של IC עם תמיסת מלח סטרילית ולכסות אותו עם וזלין, מילוי שנוצר גם לאחר ביצוע הקיר סביב חלון ההקלטה.
  18. להזריק תת עורי עצירות (0.03 מ"ג / ק"ג, בדילול 1:10 ב מלח סטרילית) כמשכך כאבים.
  19. שמור את החיה על tהוא חימום שמיכה עד מתעורר ולהחזירו לכלוב הדיור שלה להתאושש מניתוח במשך שלושה ימים לפני ההקלטות. חיות בית בכלוב rat's למגורים נפרדים כדי למנוע חבריהם לכלוב מנקים את הג'לי ואת headpost לגעת כיסוי מתכת-רשת. מקום קצת העשרה בכלוב כאשר החיה שוכנת יחידה. כמו כן, שינוי יומי בנסורת כדי למנוע הידבקות ובזהירות לבדוק שהחיה משחזרת כראוי ואינו מראה שום סימנים של אי נוחות. כמו כן לבדוק אם וזלין נגמר חלון ההקלטה בהגנה על המוח החשוף.

5. הקלטה אלקטרו Microiontophoresis

  1. לאחר התאוששות, לתת זמן החיה להסתגל לסביבת ההקלטה והטחת ראשו שלו מאופקת. לאקלם את החיה על ידי תיקון headpost לבעל בזמן שהעכבר יושב על עוצר קצף מרופד מחוייט מגולף לגודל הגוף שלה (איור 2 ב). הגה רצון זהזה התנועות של העכבר ויתרום הרוגע שלה.
  2. התחל עם 10 מפגשים דקים בהדרגה להגדיל את משך הזמן עד 120 דקות. במהלך הפגישה, לתגמל את בעלי החיים עם נוזלים מתוקים (חלב מרוכז, בדילול 30:70 במים) במרווחים נתונים 33. מאוחר יותר, במהלך ההקלטות, לתת אותו הגמול בתחילה ובסוף הפגישה או בזמן לא נוירון מבודד.
  3. אם בעל החיים הוא נרגש מאוד לקראת ההקלטה, להזריק את acepromazine הרגעה קלה (2 מ"ג / ק"ג, intraperitoneal). על פי המערכת העצבית של עניין, ההרגעה יכולה להשפיע על התוצאות שלך.
  4. בואו חיה בחופשיות לחקור את תא הקלטת עבור 5 - 10 דקות.
  5. מניחים את הגוף של בעל החיים לתוך הקצף מחוייט עוצר מרופד (איור 2 ב).
  6. אבטח את headpost לבעל המחובר למסגרת stereotactic (איור 2 ג). זהו זמן טוב לתת את חית גמול נוזלי.
  7. שיתוףVer בגופה של החיה בשמיכת כותנה ו רופף להדק אותו באמצעות hemicylinder פלסטיק דבק.
  8. הסר את וזלין מחלון ההקלטה ולשטוף עם מלח סטרילית חם.
  9. פעילות עצבית שיא ויישום iontophoretic של gabazine.
    1. מניחים את האלקטרודה multibarrel למחזיק בה, הנשלט על ידי microdrive ומצורפת micromanipulator.
    2. חברו את חוטי עבור הקלטה, באמצעות קטעי תנין קטן. חבר את הקוטב החיובי עד הסוף של אלקטרודה טונגסטן, ומסוף הקרקע אל חוט הכסף כי מגעים ההדורים.
    3. הוסף חוט כסף ציפוי בתוך כל חבית, כך קשר בקצה אחד הפתרון ואת הקצה השני הוא נגיש. חבר אלה קצוות למכשיר microiontophoresis, ביצוע ההוראות של היצרן.
    4. הזז את האלקטרודה multibarrel עד מגעי קצה השטח של המוח. החל מלח סטרילית חם כדי למנוע התייבשות של הרקמת מוח דואר. בשלב זה להחיל הנוכחי השמירה (-10 Na עבור gabazine, לבדוק בספרות עבור תרופה מסוימת) כדי למנוע דליפה של התרופה מהקצה חבית כשחיפשתי פעילות יחידה אחת.
    5. להשתמש בטכניקות מקובלות לבודד פעילות תאי עצב יחיד. השג באזור תגובת תדר (FRA) של הנוירון, כלומר, השילוב של תדרים ועוצמות מסוגלות לעורר תגובה כי הנוירון רגיש הקולות האלה 34-36.
    6. בחר שני תדרים (F1 ו- F2) שמעוררים שיעור דפוס ירי דומה. בפני כל אחד התדרים האלה גירוי נדיר וחוזר על עצמו כמו תחת הפרדיגמה המוזר.
      הערה: בקצרה, בתוך הפרדיגמה המוזר, תדר אחד (F1) מוצג הגירוי חוזר עם סבירות גבוהה להתרחשות, ואילו השני (F2) הוא הגירוי הסוטה רק לעתים נדירה מתרחש, וביניהם באופן אקראי בין אלו חוזרות. בתוך רצף שני מוזר, יחסיתהסתברויות של שני הגירויים הפוכות. פרטים של הפרדיגמה גירוי תוארו בעבר 22,37.
    7. שחרר את gabazine ידי העברת הזרם לערכים חיוביים (10 - 20 Na). השג שוב את FRA וחזור על הפרדיגמה המוזר הנמצאת בתחולת gabazine. שמירה על הפליטה עד השפעה גלויה קצב הירי הוא ציין; זה בדרך כלל לוקח 5 - 20 דקות, תלוי תרופה המסוימת, ריכוזו, ואת הגודל של זרם הפליטה. חזור על פרוטוקול ההקלטה להשיג את הערכים תחת השפעת התרופה.
    8. עצור את ההזרקה ידי החזרת הנוכחית לערכי שמירה. חכה ההשפעה של התרופה כדי לשטוף על ידי ניטור כי FRA או בתגובת הפרדיגמה המוזר חוזרת לשלוט ערכים.
      הערה: ההקלטות יכולות להימשך 2 - 3 שעות ביום, צריך להסתיים מוקדם יותר אם החיה מראה שום סימן של אי נוחות או נאבק. תן נוזל גמול ולכסות את CH ההקלטהAmber עם וזלין.

6. ניתוח נתונים

  1. מדוד את FRA לפני ובמהלך הזרקת gabazine וכן רמת SSA.
  2. לכמת את עוצמת התגובה SSA במדד משותף-SSA (CSI) ומדד SSA תדר ספציפי (SI) כפי שתואר לעיל 19,22,23,38,39. פרק מת"ם ו- SI לשקף את הפער המנורמל בין התגובה העצבית לגירוי הנדיר התגובה אחד חוזר על עצמו. ערכי CSI ו SI חיוביים לציין את התגובה העצבית (קוצים לכל גירוי) היו גבוהים יותר נדיר מאשר צלילים חוזרים.
  3. השוואת נתוני המצב מלא פליטת תרופה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הקלטנו את הפעילות היחידה אחת של 4 נוירונים היטב מבודדים של IC. יחסי אות לרעש אופייניים שהושגו במהלך הקלטות תאיות בעכברים ערים מוצגים באיור 3 ב. איור 4 א מציג את אזור תגובת תדר (FRA) של כל נוירון לפני ובמהלך המצור של GABA A -receptors עם gabazine. תוספת של כוח התגובה (קוצים / גירוי) וכן רחבה של כוונון ספקטרלי נצפתה. התוספת בתגובת עורר בו הייתה ניכרת גם היסטוגרמות הזמן המצטבר פרי-גירוי מתקבל התגובה העצבית לכל התדרים והעוצמים הציגה (האיור 4B).

זוג אחד או שניים של תדרים בתוך של FRA נוירון (צלבים באיור 4 א) נבחרו שיוצג כצלילים החוזרים על עצמן או נדירים פרדיגמה מוזר, נTudy רמת SSA בתשובותיהם. במשך שני נוירונים לדוגמה, התגובות עוררו צליל כל תדר (F1 ו- F2) לפני ובמהלך הזרקת gabazine מוצגים rasters נקודה באיור 5A, B. עבור שני נוירונים למשל, חל שינוי ברור בתגובת עורר הקול כפי שנצפה סריקת הנקודה PSTHs.

כמו כן, המצור המקומי של -receptors GABA A הגדיל את התגובה העצבית הרוב הגדול של גוונים נדירים חוזרים (איור 5 ג) בהסכם עם המחקר קודם שלנו 16. רמות שונות של SSA נצפו תגובות עצביות כדי F1 ו- F2, שהתבטאה CSI חיובית (מרווח CSI: -0.26 עד 0.43, 0.25 ± 0.23) וערכי SI (מרווח SIs: -0.41 עד 0.83, 0.25 ± 0.23) . במשך רוב המקרים, התגובה המוגברת לצליל החוזר גרמה לירידה במדדים אלה כפי שנצפתה 5D איור

איור 1
חומר באיור 1. לייצור אלקטרודות טונגסטן. (א) אלקטרודה כלי יישור, עם כמה חוטי טונגסטן במקום. היצירה הקלה בצד השמאל היא להפסיק את החוטים. הטיפ המספרי מציין את הצד לשמש כמדריך לחיתוך החוטים באורך הרצוי. (ב) ציר ריק. (C) ציר עם קבוצה של אלקטרודות המחוברות, ומונח על בעל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2
איור 2. אביזרי הקלטות עכברים Awake. (א) Headpost. (ב) מחוייט עוצר קצף מרופד. מקום tהוא העכבר בין שתי חתיכות, עוזב את הראש בחוץ. (C) שינויים למסגרת stereotaxic. בעל headpost (בסרגל העליון) מסייעת במהלך ההשתלה headpost ו מגביל את הראש במהלך ההקלטות. יצירת הביס (בר נמוך) משמשת רק במהלך השתלת headpost. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. דוגמא של הקלטה של העכבר הער. (א) באזור תגובת תדר של נוירון מהעכבר IC. (ב) Waveforms של הקוצים רשמו מן הנוירון זו. (C, D) סריקת דוט היסטוגרמה peristumulus הפעמית שנרשמה בגין נוירון זה באמצעות הפרדיגמה מוזר בתדרים הצביע על ידי הנקודות (A). מצויר מחדש מנתוניםפורסם ב Duque ו Malmierca 26. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
אפקט איור 4. של המצור של גאבא -receptors על ספקטרלית מאפייני תגובה זמנית. (א) תדירות התגובה באזור של ארבע IC רשמה נוירונים לפני ובמהלך הזרקת microiontophoretic של gabazine. הצלבים השחורים ב (א) לציין את התדרים שנבחרו שיוצגו כצלילים נדירים וחוזרים על עצמו. (ב) מצטבר היסטוגרמות זמן פרי-גירוי של התגובה העצבית לכל התדרים והעוצמים הציגו לבנות באזור התגובה לפני ובמהלך הזריקה של gabazine. הפסים השחורים לציין את משך הצליל.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. השפעת המצור של GABA A לקולטנים על תגובת צלילים חוזרים ונדירים. (A, B) Dot rasters תגובת spiking לזוג התדרים המוצגים נדיר (אדום, 10%) ו גירוי חוזר על עצמו (כחול, 90%) לפני ובמהלך היישום של gabazine. תדירות כל הוא שיחק בשני רצפים כך שכל אחד הוצג rare- וחוזר על עצמו. הרקע המוצל מציין את משך הגירוי. (C). תגובות חד הנוירון שבעה זוגות של תדרים הציגו כמו נדיר כמו הקול חוזר לפני ובמהלך היישום של gabazine. (ד) לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microiontophoresis של חומרי neuroactive בחיות ערות הוא טכניקה רבה עצמה כדי לחקור לנתח את התפקיד של תשומות הסינפטי ספציפיות על פעילות נוירונים בודדים 40,41. יתרה מכך, הליך זה מאפשר קביעת ההשפעה של נוירוטרנסמיטורים neuromodulators על מעגלים עצביים ללא הפרעה האפשרית של הרדמה. הנה, אנחנו מדגימים כי הבקשה של gabazine ב IC של עכברים ערים וחסונה שינתה את כוונון התדר (איור 4 א), את דפוסי תגובה הזמניים (האיור 4B) ואת SSA (איור 5).

המגבלה העיקרית של ההליך המתואר הוא זמן ההקלטה קצר יחסית (~ 3 שעות), אשר נקבע על ידי רמת הרגלה של החיה כדי ההקלטות. מצד השני, הקלטות מרובות יכולות להתבצע על החיה אותו. שימוש microiontophoresis לא ברור כמה רחוקחומרי neuroactive להחיל מפוזר לתוך הרקמה שמסביב. לכן, השפעה אפשרית על פעילות רשת עצבית ניתן שהושרה על ידי משפיעים לא רק הנוירון המוקלט אלא גם את גליה שמסביב תאים עצביים. לדוגמה, סוכריות ועמיתיו 42 הראו כי מולקולות מסוימות נמסר iontophoretically, אשר לא יוסרו במהירות, יכול לפזר עד 600 מיקרומטר. בעכברי IC בטווח זה יכסה את רוב היקף הסוכות דנדריטים אלא גם להשפיע על התגובה העצבית של תאים סמוכים. לסיכום, התרופה שפורסמה על ידי iontophoresis אינה כפי מוגבל מרחבית כמו דיאליזת תרופה תאית, המאפשרת דיסקציה בפירוט מדויק יותר של התשומות הסינפטי לנוירון היעד והבדיקה של רשת מקומית מעבדת 16,43, זה יותר ספציפי מאשר ניסיוני אחר נהלים להשתמש כדי לתפעל את הרמה עצבית או neuromodulation, כגון זריקות מערכתיות, שימוש בטכניקות optogenetic, או שכיבות pulדיאליזה l.

קוטר קצה טפטפות הזכוכית ואת עוצמת זרמי שימור הזרקה הם גורמי מפתח כדי לפקח על מנת למנוע דליפת תרופה ספציפית לתוך הרקמה. זרמי ההזרקה הנמוכים (בסדר גודל של עשרות Na) להגביל את ההתפשטות של התרופה המאפשר הקלטה של ​​נוירונים קרובים אחד לשני. לדוגמה, שלושה מתוך ארבעת נוירונים לשמש דוגמאות (נוירונים 1 - 3) נרשמו לאורך המסלול אותו עם מרחקים של 16 ו 800 מיקרומטר ביניהם. למרות המרחק הקצר של 16 מיקרומטר בין נוירון 1 ו -2, תגובה שונה בבירור של נוירון 2 נצפתה (איור 4).

כמה חלופות בתצורת קופה גב המוצע שימשו בעבר. אחד מהם מורכב שימוש אחד טפטפות multibarrel להקלטה, במקום אלקטרודה נפרדת. בעוד הבנייה של הרכבים היא פחות מסובכת במקרה זה, יש חסרונות. first, כל הערוצים יהיו באותו קוטר הפתח בקצה, אשר לא יכול להיות אופטימלית הוא להקלטת משלוח סמים. כמו כן, קצה האלקטרודה הבולט בתצורת קופת הגב מונע ניזק לתא המטרה הנגרם ככל הנראה על ידי הקצה הרחב יותר של multibarrel. החלופה הנפוצה השנייה היא השימוש טפטפות זכוכית חד-קניים להקלטת 15,44 במקום אלקטרודות טונגסטן. אלקטרודות זכוכית קלות לייצר למידות הנדרשות, אבל נוטה לסתום במהלך הקלטות ארוכות או בעת הנסיעה עמוקה לתוך המוח, כך אלקטרודות טונגסטן מניסיוננו לספק הקלטות אמינות יותר. יתר על כן, באמצעות אלקטרודות טונגסטן אפשר לייצר נגע אלקטרוליטי לאתר את אתרי הקלטה, ללא נהלים היסטולוגית לפרט יותר נדרשים כאשר הזרקה נותב עצביים משמשת 45. השימוש טפטפות זכוכית multibarrel מאפשר שחרור אגוניסטים מרובים ו / או יריבים קרובים מאוד להקלטהאתר, וזה יתרון עצום כאשר האינטראקציה בין מערכות הנוירוטרנסמיטר על עיבוד חושי היא נחקרת.

הנהלים המתוארים בפרוטוקול הנוכחי לייצור האלקטרודות גב פיגי מאפשרים לייצר אלקטרודות הקלטה על פי הדרישות הספציפיות של הניסוי ושל המאפיינים של אזור היעד של עניין שיטתי, עדיין בצורה אישית. בנוסף, החומרים עבור קיבעון headpost משמשים כמקובל ברפואת שיניים כך שהם זמינים. לכן, את השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם ההרגלה החיה ואת התחריט של אלקטרודות טונגסטן, אשר הם הגורמים המרכזיים שתרמו נוירונים היטב מבודד הקלטות אלקטרו יציבות. בסך הכל, טכניקה זו היא פשוטה יחסית, חסכונית מאוד אמינה כאמצעי כדי ללמוד את התפקיד של חומרי neuroactive מרובים על פעילות עצבית יחידה או רבה-יחידה ערה, ראשעכברים מאופקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

פרויקט זה מומן על ידי MINECO מעניקה BFU201343608-P ו PSI2013-49348-EXP, ואת SA343U14 מענק JCYL למימון הליבה MSM ו- MRC כדי ARP. YAA קיימה CONACyT (216,106) ו המילגה SEP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tungsten wire Harvard Apparatus LTD 33-0099 0.005 inches x 3 inches
Borosilicate glass capillary  Harvard Apparatus LTD 30-0053 Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long
Multibarrel glass capillaries  World Precision Instruments 5B120F-4  5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament
Diaplus DiaDent 2001-2101 Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette
G-Bond GC Corporation 2277 Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull
Charisma Heraeus Kulzer 66000087 Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull
Araldit Cristal Ceys 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette
Heating blanket Cibertec RTC1
Stereotactic frame Narishige SR-6N Modified for mice
Microiontophoretic device Harvard Apparatus LTD Neurophore BH-2 Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module
Multibarrel glass pipette puller Narishige Model PE-21
LED lamp Technoflux CV-215 5 W, 430-485 nm
MicroFil World Precision Instruments MF34G-5 Flexible plastic needle, 34 AWG
Imalgene Merial Ketamine, 100 mg/mL
Rompun Bayer Xylazine, 20 mg/mL
Gabazine / SR-95531 Sigma S106 Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harris, K. D., Thiele, A. Cortical state and attention. Nat Rev Neurosci. 12 (9), 509-523 (2011).
  2. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  3. Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Frohlich, F. Awake vs. anesthetized: layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
  4. Haider, B., Hausser, M., Carandini, M. Inhibition dominates sensory responses in the awake cortex. Nature. 493 (7430), 97-100 (2013).
  5. Rudolph, M., Pospischil, M., Timofeev, I., Destexhe, A. Inhibition determines membrane potential dynamics and controls action potential generation in awake and sleeping cat cortex. J Neurosci. 27 (20), 5280-5290 (2007).
  6. Buran, B. N., von Trapp, G., Sanes, D. H. Behaviorally gated reduction of spontaneous discharge can improve detection thresholds in auditory cortex. J Neurosci. 34 (11), 4076-4081 (2014).
  7. Duque, D., Malmierca, M. S., Caspary, D. M. Modulation of stimulus-specific adaptation by GABA(A) receptor activation or blockade in the medial geniculate body of the anaesthetized rat. J Physiol. 592, (Pt 4) 729-743 (2014).
  8. Stone, T. W. Microiontophoresis and Pressure Ejection. , Wiley. (1985).
  9. Lalley, P. M. Modern techniques in neuroscience research). Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. 193-212 (1999).
  10. Foeller, E., Celikel, T., Feldman, D. E. Inhibitory sharpening of receptive fields contributes to whisker map plasticity in rat somatosensory cortex. J Neurophysiol. 94 (6), 4387-4400 (2005).
  11. Foeller, E., Vater, M., Kossl, M. Laminar analysis of inhibition in the gerbil primary auditory cortex. J Assoc Res Otolaryngol. 2 (3), 279-296 (2001).
  12. Kurt, S., Crook, J. M., Ohl, F. W., Scheich, H., Schulze, H. Differential effects of iontophoretic in vivo application of the GABA(A)-antagonists bicuculline and gabazine in sensory cortex. Hear Res. 212 (1-2), 224-235 (2006).
  13. Sivaramakrishnan, S., et al. GABA(A) synapses shape neuronal responses to sound intensity in the inferior colliculus. J Neurosci. 24 (21), 5031-5043 (2004).
  14. Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing 'piggy-back' multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 48 (2), 249-251 (1980).
  15. Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses. J Vis Exp. (71), e4358 (2013).
  16. Perez-Gonzalez, D., Hernandez, O., Covey, E., Malmierca, M. S. GABA(A)-Mediated Inhibition Modulates Stimulus-Specific Adaptation in the Inferior Colliculus. PLoS ONE. 7 (3), e34297 (2012).
  17. Bullock, D. C., Palmer, A. R., Rees, A. Compact and easy-to-use tungsten-in-glass microelectrode manufacturing workstation. Med Biol Eng Comput. 26 (6), 669-672 (1988).
  18. Sugiyama, K., Dong, W. K., Chudler, E. H. A simplified method for manufacturing glass-insulated metal microelectrodes. J Neurosci Methods. 53 (1), 73-80 (1994).
  19. Ulanovsky, N., Las, L., Nelken, I. Processing of low-probability sounds by cortical neurons. Nat Neurosci. 6 (4), 391-398 (2003).
  20. Escera, C., Malmierca, M. S. The auditory novelty system: An attempt to integrate human and animal research. Psychophysiology. 51 (2), 111-123 (2014).
  21. Malmierca, M. S., Sanchez-Vives, M. V., Escera, C., Bendixen, A. Neuronal adaptation, novelty detection and regularity encoding in audition. Front Syst Neurosci. 8, 111 (2014).
  22. Malmierca, M. S., Cristaudo, S., Perez-Gonzalez, D., Covey, E. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the anesthetized rat. J Neurosci. 29 (17), 5483-5493 (2009).
  23. Antunes, F. M., Nelken, I., Covey, E., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the auditory thalamus of the anesthetized rat. PLoS ONE. 5 (11), 14071 (2010).
  24. von der Behrens, W., Bauerle, P., Kossl, M., Gaese, B. H. Correlating stimulus-specific adaptation of cortical neurons and local field potentials in the awake rat. J Neurosci. 29 (44), 13837-13849 (2009).
  25. Perez-Gonzalez, D., Malmierca, M. S. Variability of the time course of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 107 (2012).
  26. Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Struct Funct. , (2014).
  27. Merrill, E. G., Ainsworth, A. Glass-coated platinum-plated tungsten microelectrodes. Med Biol Eng. 10 (5), 662-672 (1972).
  28. Ainsworth, A., Dostrovsky, J. O., Merrill, E. G., Millar, J. An improved method for insulating tungsten micro-electrodes with glass [proceedings]. J Physiol. 269 (1), 4-5 (1977).
  29. Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178 (1), 75-79 (2009).
  30. Portfors, C. V., Roberts, P. D., Jonson, K. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162 (2), 486-500 (2009).
  31. Portfors, C. V., Mayko, Z. M., Jonson, K., Cha, G. F., Roberts, P. D. Spatial organization of receptive fields in the auditory midbrain of awake mouse. Neuroscience. 193, 429-439 (2011).
  32. Muniak, M. A., Mayko, Z. M., Ryugo, D. K., Portfors, C. V. Preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers. J Vis Exp. (64), (2012).
  33. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
  34. Malmierca, M. S., et al. A discontinuous tonotopic organization in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 28 (18), 4767-4776 (2008).
  35. Izquierdo, M. A., Gutierrez-Conde, P. M., Merchan, M. A., Malmierca, M. S. Non-plastic reorganization of frequency coding in the inferior colliculus of the rat following noise-induced hearing loss. Neuroscience. 154 (1), 355-369 (2008).
  36. Palmer, A. R., Shackleton, T. M., Sumner, C. J., Zobay, O., Rees, A. Classification of frequency response areas in the inferior colliculus reveals continua not discrete classes. J Physiol. 591 (16), 4003-4025 (2013).
  37. Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation and deviance detection in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 89 (2013).
  38. Duque, D., Perez-Gonzalez, D., Ayala, Y. A., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Topographic distribution, frequency, and intensity dependence of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 32 (49), 17762-17774 (2012).
  39. Ayala, Y. A., Perez-Gonzalez, D., Duque, D., Nelken, I., Malmierca, M. S. Frequency discrimination and stimulus deviance in the inferior colliculus and cochlear nucleus. Front Neural Circuits. 6, 119 (2013).
  40. Perkins, M. N., Stone, T. W. In vivo release of [3H]-purines by quinolinic acid and related compounds. Br J Pharmacol. 80 (2), 263-267 (1983).
  41. Lalley, P. M. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin Heiderlberg. Ch. 7 193-212 (1999).
  42. Candy, J. M., Boakes, R. J., Key, B. J., Worton, E. Correlation of the release of amines and antagonists with their effects. Neuropharmacology. 13 (6), 423-430 (1974).
  43. Martins, A. R., Froemke, R. C. Coordinated forms of noradrenergic plasticity in the locus coeruleus and primary auditory cortex. Nat Neurosci. , (2015).
  44. LeBeau, F. E., Rees, A., Malmierca, M. S. Contribution of GABA- and glycine-mediated inhibition to the monaural temporal response properties of neurons in the inferior colliculus. Journal of Neurophysiology. 75 (2), 902-919 (1996).
  45. Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Cholinergic modulation of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. The Journal of Neuroscience. 35 (35), 12261-12272 (2015).

Tags

Neuroscience גיליון 111 שמיעה הסתגלות ספציפית גירויים colliculus הנחה gabazine עיכוב אזור תגובת תדר multibarrels אלקטרודה טונגסטן תשומות הסינפטי
הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ayala, Y. A.,… More

Ayala, Y. A., Pérez-González, D., Duque, D., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice. J. Vis. Exp. (111), e53914, doi:10.3791/53914 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter