Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake
Summary
We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.
Abstract
Las diferencias en la actividad de los neurotransmisores y neuromoduladores, y por consiguiente diferentes respuestas neuronales, se pueden encontrar entre los animales anestesiados y despierto. Por lo tanto, se requieren métodos que permiten la manipulación de los sistemas de sinápticas en animales despiertos con el fin de determinar la contribución de entradas sinápticas con el procesamiento neuronal no afectado por los anestésicos. A continuación, presentamos metodología para la construcción de electrodos para registrar simultáneamente la actividad neuronal extracelular y liberar varias sustancias neuroactivos en las proximidades de los sitios de grabación en ratones despiertos. Mediante la combinación de estos procedimientos, se realizó inyecciones microiontophoretic de gabazine para bloquear selectivamente los receptores GABA A en las neuronas del colículo inferior de los ratones de cabeza-restringido. Gabazine modificado correctamente las propiedades de respuesta neural, como la zona de respuesta de frecuencia y adaptación a estímulos específicos. De este modo, se demuestra que nuestros métodos son adecuados para recording actividad de una sola unidad y para disecar el papel de los receptores de neurotransmisores específicos en el procesamiento auditivo.
La principal limitación del procedimiento descrito es el tiempo de grabación relativamente corto (~ 3 hr), que se determina por el nivel de habituación del animal a las sesiones de grabación. Por otra parte, múltiples sesiones de grabación se puede realizar en el mismo animal. La ventaja de esta técnica sobre otros procedimientos experimentales utilizados para manipular el nivel de la neurotransmisión o neuromodulación (tales como inyecciones sistémicas o el uso de modelos optogenética), es que el efecto del fármaco se limita a las entradas sinápticas locales a la neurona diana. Además, la costumbre-fabricación de electrodos permite el ajuste de los parámetros específicos de acuerdo con la estructura neural y el tipo de neurona de interés (tales como la resistencia de punta para mejorar la relación señal-ruido de las grabaciones).
Introduction
La interacción de la excitación neuronal y la inhibición es fundamental para el procesamiento de la información sensorial 1. También se sabe que la anestesia tiene un fuerte impacto sobre la dinámica de la activación cortical y el patrón temporal de entradas sinápticas 2,3. Por ejemplo, se ha observado que los anestésicos alteran la duración de las respuestas evocadas visualmente en las neuronas corticales 3,4. Además, la relación entre excitatorios e inhibitorios entradas sinápticas es diferente en animales anestesiados y despiertos 4,5, alterando tanto evocados y las tasas de actividad espontánea 6,7. Mediante la medición de las conductancias sinápticas, Haider y sus colegas encontraron que la inhibición 4 emparejado en amplitud de excitación bajo anestesia mientras que durante la vigilia, la inhibición fue más fuerte que la excitación. Estos hallazgos impulsan el desarrollo de procedimientos experimentales para estudiar el impacto de las entradas sinápticas específicas en el procesamiento sensorial en animales despiertos.
<clase p = "jove_content"> La eyección controlada de sustancias neuroactivos cargadas mediante la aplicación de pequeñas inyecciones de corriente (del orden de nA) se ha utilizado ampliamente para estudiar la contribución de las entradas sinápticas y la función de los receptores de las células tumorales en el procesamiento sensorial 8-13 . Esta técnica, conocida como microiontophoresis, permite la aplicación de medicamentos en la vecindad de la neurona registrada, que contribuye a un efecto rápido y confinado. Este procedimiento es más adecuado para el estudio de los efectos locales de sustancias neuroactivos, en comparación con el efecto generalizado provocada por otras manipulaciones experimentales, tales como inyecciones sistémicas, microdiálisis o el uso de técnicas de optogenética. Por lo general, una configuración de electrodos de lengüeta de la 14,15 se utiliza para registrar simultáneamente la neurona diana y entregar las sustancias neuroactivos de interés. Se compone de un electrodo de registro conectado a una pipeta de tubos múltiples que transporta las sustancias neuroactivos. Las modificaciones de la juntariginal procedimiento descrito por Havey y Caspary 14 se han implementado. Por ejemplo, un electrodo de tungsteno, en lugar de uno de vidrio, se pueden utilizar para registrar la actividad neural 16. Métodos publicados anteriormente para la fabricación de electrodos de tungsteno 17,18 involucran tres pasos generales: grabado electrolítico de las puntas de alambre de tungsteno, el aislamiento de vidrio, y el ajuste de la exposición de punta para satisfacer las necesidades de grabación.Un campo interesante y emergente de la neurociencia auditiva es el estudio de la adaptación-estímulo específico (SSA 19). SSA es una disminución específica en la respuesta neuronal a los sonidos repetitivos que no se generaliza a otros sonidos, rara vez se presentan. La importancia de la SSA reside en su papel potencial como una detección de la desviación subyacente mecanismo neural en el cerebro auditivo, así como un posible correlato neuronal para el componente de desajuste negatividad tardía del potencial evocado auditivo 20,21. SSA occurs de la IC hasta la corteza auditiva 19,22-24. GABA A inhibición mediada ha sido demostrada para actuar como un mecanismo de control de ganancia en SSA 7,16,25, que también se ha demostrado a ser afectados por la anestesia 26. Aquí se presenta un protocolo que combina los métodos descritos anteriormente para el registro de la actividad de una sola unidad de neuronas IC antes y durante la aplicación de un antagonista selectivo de los receptores GABA A en ratones despiertos. En primer lugar, se describe la fabricación de electrodos de piggy-back y el próximo, los métodos quirúrgicos y de grabación. Para probar la eficacia de la liberación del fármaco, se comparó el campo receptivo, así como el nivel de la SSA de las neuronas del CI antes y durante la eyección de microiontophoretic gabazine.
Protocol
Representative Results
Discussion
El microiontophoresis de sustancias neuroactivos en animales despiertos es una técnica poderosa para sondar y diseccionar el papel de entradas sinápticas específicas sobre la actividad de las neuronas individuales 40,41. Más importante aún, este procedimiento permite la determinación de los efectos de los neurotransmisores y neuromoduladores en los circuitos neurales sin la interferencia potencial de los anestésicos. Aquí, nos demuestran que la aplicación de gabazine en el CI de los ratones despierto…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por el MINECO otorga BFU201343608-P y PSI2013-49348-CAD, y la subvención a la financiación SA343U14 JCYL HSH y MRC núcleo de ARP. YAA llevó a cabo una CONACyT (216.106) y una beca-SEP-.
Materials
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
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