Die extrazelluläre Aufnahme neuronaler Aktivität in Kombination mit Microiontophoretic Anwendung von neuroaktiven Substanzen in Awake Mäuse

Summary

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Abstract

Unterschiede in der Aktivität von Neurotransmittern und Neuromodulatoren und folglich verschiedene neuronale Reaktionen können zwischen narkotisierten und wachen Tieren gefunden werden. Daher sind Verfahren ermöglicht die Manipulation von synaptischen Systeme in wach Tiere erforderlich, um den Beitrag der synaptischen Eingaben neuronalen Verarbeitung unbeeinflußt von Anästhetika zu bestimmen. Hier stellen wir Methoden zur Konstruktion von Elektroden gleichzeitig extrazelluläre neuronale Aktivität aufzuzeichnen und mehrere neuroaktive Substanzen freisetzen in der Nähe der Aufzeichnungs Seiten in wach Mäusen. Durch diese Verfahren kombiniert, führten wir microiontophoretic Injektionen von Gabazin selektiv zu GABA – _A – Rezeptoren in Neuronen des Colliculus inferior von Kopf-gezügelt Mäuse blockieren. Gabazin erfolgreich Nervenreaktionseigenschaften wie beispielsweise die Frequenzantwortbereich und Stimulusspezifische Anpassung modifiziert. Somit zeigen wir, dass unser Verfahren geeignet sind, recording Single-Unit-Aktivität und für die Rolle der spezifischen Neurotransmitter-Rezeptoren in auditorischen Verarbeitung sezieren.

Die Haupteinschränkung des beschriebenen Verfahrens ist die relativ kurze Aufnahmezeit (~ 3 h), die durch die Höhe der Gewöhnung des Tieres zu den Aufnahmen bestimmt. Auf der anderen Seite können mehrere Aufnahmen in demselben Tier durchgeführt werden. Der Vorteil dieser Technik gegenüber anderen experimentellen Verfahren verwendet, um das Niveau der Neurotransmission oder Neuromodulation (wie systemische Injektionen oder die Verwendung von optogenetische Modelle) zu manipulieren, ist, dass die Arzneimittelwirkung auf die lokalen synaptischen Eingaben in das Zielneurons beschränkt. Darüber hinaus ermöglicht die kundenspezifische Herstellung von Elektroden Einstellung bestimmter Parameter entsprechend der neuralen Struktur und Art des Neurons von Interesse (beispielsweise der Spitze Widerstand zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis der Aufnahmen).

Introduction

Das Zusammenspiel von neuronalen Erregung und Hemmung ist von grundlegender Bedeutung für die Verarbeitung von Sinnesinformationen ^1. Es ist auch bekannt , dass der Anästhesie einen starken Einfluss auf die Dynamik der kortikalen Aktivierung hat und das zeitliche Muster der synaptischen Eingänge ^2,3. Beispielsweise wurde beobachtet , daß Anästhetika die Dauer visuell hervorgerufenen Reaktionen in kortikalen Neuronen ^3,4 verändern. Darüber hinaus unterscheidet sich das Verhältnis zwischen erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge in narkotisierten und wachen Tieren ^4,5, zu verändern sowohl evozierten und spontanen Aktivitätsraten ^6,7. Durch die synaptischen Leitwerte Messung, Haider und Kollegen ⁴ gefunden , dass die Hemmung abgestimmt Erregung in Amplitude unter Narkose während im Wachzustand, Hemmung stärker als Anregung war. Diese Ergebnisse veranlassen, die Entwicklung von experimentellen Verfahren, die Auswirkungen der spezifischen synaptischen Eingänge auf die sensorische Verarbeitung in wach Tiere zu studieren.

<p class = "jove_content"> Die gesteuerte Ausstoß von geladenen neuro Substanzen durch kleine Strominjektionen Anwendung (in der Größenordnung von nA) wurde ausgiebig verwendet , um den Beitrag der synaptischen Eingänge zu untersuchen und die Rolle der vermeintlichen Zell – Rezeptoren in der sensorischen Verarbeitung ^8-13 . Diese Technik, die als microiontophoresis bekannt ist, ermöglicht die Anwendung von Medikamenten in der Nähe des aufgezeichneten neuron, was zu einem schnellen und beschränkte Wirkung beiträgt. Dieses Verfahren ist besser geeignet für lokale Effekte von neuroaktiven Substanzen studiert, im Vergleich zu den weit verbreiteten Effekt durch andere experimentelle Manipulationen, wie systemische Injektionen, Mikrodialyse oder die Verwendung von optogenetische Techniken ausgelöst. Üblicherweise wird eine Huckepack-Elektrodenkonfiguration ^14,15 wird verwendet , um gleichzeitig das Ziel Neuron aufnehmen und die neuro Substanzen von Interesse zu liefern. Es besteht aus einer Aufzeichnungselektrode mit einem mehrgehäusigen Pipette angebracht, die die neuroaktiven Substanzen trägt. Abwandlungen der original Verfahren von Havey und Caspary ¹⁴ umgesetzt wurden. Beispielsweise eine Wolframelektrode, anstelle einer Glas ein, verwendet werden , um die neuronale Aktivität ¹⁶ aufzunehmen. Bisher veröffentlichte Verfahren zur Herstellung von Wolframelektroden ^17,18 umfassen drei allgemeine Schritte: elektrolytische Ätzen von Wolfram Drahtspitzen, Glasisolierung, und die Einstellung der Spitze Belichtung , um die Aufnahme Anforderungen erfüllen.

Ein interessantes und emergent Feld in auditorische Neurowissenschaften ist die Untersuchung der Stimulus spezifische Anpassung (SSA ^19). SSA ist eine spezifische Abnahme der neuronalen Reaktion auf sich wiederholende Geräusche, die nicht auf andere, selten präsentiert Klänge nicht verallgemeinern. Die Bedeutung der SSA liegt in ihrer möglichen Rolle als neuronales Mechanismus zugrunde liegende deviance Detektion im auditorischen Gehirn sowie eine mögliche neuronale Korrelat für die späte Mismatch – Negativität Komponente des Gehör Potential ^20,21 evozierte. SSA occurs vom IC bis zum auditorischen Cortex ^19,22-24. GABA _A -vermittelte Hemmung wurde als Verstärkungssteuerungsmechanismus auf SSA ^7,16,25, die auch gezeigt wurde , werden beeinflußt durch Anästhesie ²⁶ einwirken demonstriert. Hier stellen wir ein Protokoll , das für die Aufzeichnung der Single-Unit – Aktivität von IC – Neuronen vor und während der Anwendung eines selektiven Antagonisten der GABA _A -Rezeptoren in wachen Mäusen zuvor beschriebenen Verfahren kombiniert. Zunächst beschreiben wir die Herstellung von Huckepack-Elektroden und anderen, den chirurgischen und Aufzeichnungsverfahren. Um die Wirksamkeit der Wirkstofffreisetzung zu testen, verglichen wir die rezeptiven Feld sowie das Niveau der SSA von IC-Neuronen vor und während der microiontophoretic Ausstoß von Gabazin.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden an der Universität von Salamanca mit der Zustimmung durchgeführt und unter Verwendung von Methoden, um die Standards der konformen, der Universität von Salamanca Animal Care Committee sowie die Standards der Europäischen Union (Richtlinie 2010/63 / EU) für die Verwendung von Tieren in der neurowissenschaftlichen Forschung. 1. Wolframelektroden Anmerkung: Die Herstellung von Wolframelektroden basiert auf der ursprünglichen Technik beschrieben in Merrill und Ainswo…

Representative Results

Wir nahmen die Single-Unit-Aktivität von 4 gut isolierte Neuronen des IC. Typische Signal-zu-Rausch – Verhältnisse bei der extrazellulären Aufzeichnungen in wach Mäusen sind in 3B gezeigt. 4A zeigt den Frequenzgang Bereich (FRA) jedes Neurons vor und während der Blockade der GABA A -Rezeptoren mit Gabazin. Ein Inkrement in der Antwortstärke (spikes / Stimulus) sowie einer Verbreiterung der spektralen Verschiebung beobachtet. Das Inkremen…

Discussion

Die microiontophoresis von neuroaktiven Substanzen in wachen Tieren ist eine leistungsstarke Technik zur Sonde und die Rolle der spezifischen synaptischen Eingaben auf die Aktivität der einzelnen Neuronen ^40,41 sezieren. Noch wichtiger ist, ermöglicht dieses Verfahren die Bestimmung der Auswirkungen der Neurotransmitter und Neuromodulatoren auf neuronale Schaltkreise ohne die mögliche Störung von Anästhetika. Hier zeigen wir , dass die Anwendung von Gabazin in dem IC von wach Mäusen robust die Frequenze…

Materials

Tungsten wire	Harvard Apparatus LTD	33-0099	0.005 inches x 3 inches
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus LTD	30-0053	Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long
Multibarrel glass capillaries	World Precision Instruments	5B120F-4	5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament
Diaplus	DiaDent	2001-2101	Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette
G-Bond	GC Corporation	2277	Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull
Charisma	Heraeus Kulzer	66000087	Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull
Araldit Cristal	Ceys		2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette
Heating blanket	Cibertec	RTC1
Stereotactic frame	Narishige	SR-6N	Modified for mice
Microiontophoretic device	Harvard Apparatus LTD	Neurophore BH-2	Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module
Multibarrel glass pipette puller	Narishige	Model PE-21
LED lamp	Technoflux	CV-215	5 W, 430-485 nm
MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5	Flexible plastic needle, 34 AWG
Imalgene	Merial		Ketamine, 100 mg/mL
Rompun	Bayer		Xylazine, 20 mg/mL
Gabazine / SR-95531	Sigma	S106	Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4