خارج الخلية تسجيل النشاط العصبية جنبا إلى جنب مع Microiontophoretic تطبيق المواد Neuroactive في الفئران مستيقظا
Summary
We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.
Abstract
الاختلافات في نشاط الناقلات العصبية وneuromodulators، والاستجابات العصبية المختلفة وبالتالي، يمكن العثور بين الحيوانات تخدير ومستيقظا. لذلك، يطلب من أساليب تتيح التلاعب في أنظمة متشابك في الحيوانات المستيقظة من أجل تحديد مساهمة مدخلات متشابك لمعالجة الخلايا العصبية تتأثر التخدير. هنا، نقدم منهجية لبناء أقطاب لتسجيل وقت واحد النشاط العصبية خارج الخلية والافراج عن المواد neuroactive متعددة في المنطقة المجاورة للمواقع تسجيل في الفئران مستيقظا. من خلال الجمع بين هذه الإجراءات، أجرينا حقن microiontophoretic من gabazine لمنع انتقائي مستقبلات GABA ألف في الخلايا العصبية للأكيمة أدنى من الفئران ضبط النفس الرأس. Gabazine تعديل بنجاح خصائص استجابة العصبية مثل منطقة استجابة التردد والتكيف التحفيز محددة. وبالتالي، علينا أن نبرهن على طرقنا هي مناسبة لrecordinز النشاط وحدة واحدة ولتشريح دور المستقبلات العصبية المحددة في المعالجة السمعية.
القيد الرئيسي للإجراءات المنصوص مدة التسجيل قصيرة نسبيا (~ 3 ساعة)، والتي يتم تحديدها من قبل مستوى التعود من الحيوان إلى تسجيل الدورات. من ناحية أخرى، تسجيل جلسات متعددة لا يمكن أن يؤديها في نفس الحيوان. وميزة هذه التقنية على الإجراءات التجريبية الأخرى المستخدمة لمعالجة مستوى العصبي أو تعديل العمليات العصبية (مثل الحقن النظامية أو استخدام نماذج علم البصريات الوراثي)، هو أن تأثير الدواء يقتصر على مدخلات متشابك المحلية إلى الخلايا العصبية المستهدفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العرف تصنيع أقطاب يسمح تعديل معايير محددة وفقا للهيكل العصبي ونوع من الخلايا العصبية من الفائدة (مثل مقاومة نصيحة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء من التسجيلات).
Introduction
التفاعل بين الإثارة العصبية وتثبيط أمر أساسي لمعالجة المعلومات الحسية 1. ومن المعروف أيضا أن التخدير له تأثير قوي على ديناميات تفعيل القشرية ونمط الزمني للمدخلات متشابك 2،3. على سبيل المثال، فقد لوحظ أن التخدير يغير مدة الردود أثار بصريا في الخلايا العصبية القشرية 3،4. وعلاوة على ذلك، فإن النسبة بين مثير ومدخلات متشابك المثبطة مختلفة في الحيوانات تخدير ومستيقظا 4،5، وتغيير كل من أثار ومعدلات النشاط العفوي 6،7. عن طريق قياس المواصلة متشابك، وجدت حيدر وزملاؤه 4 أن تثبيط مطابقة الإثارة في السعة تحت التخدير بينما أثناء اليقظة، وتثبيط أقوى من الإثارة. هذه النتائج ستدفع تطوير الإجراءات التجريبية لدراسة تأثير مدخلات متشابك محددة بشأن معالجة الحسي في الحيوانات مستيقظا.
<وقد استخدمت الطبقة ص = "jove_content"> وطرد رقابة من المواد neuroactive التي يتقاضاها تطبيق الحقن الحالية صغيرة (بناء على أمر من غ) على نطاق واسع لدراسة مساهمة مدخلات متشابك ودور مستقبلات الخلايا المفترضة في معالجة الحسي 8-13 . هذه التقنية، المعروفة باسم microiontophoresis، تسمح للتطبيق المخدرات في محيط الخلايا العصبية المسجلة، مما يساهم في التأثير السريع والمحصورة. هذا الإجراء هو أكثر ملاءمة لدراسة الآثار المحلية من المواد neuroactive، مقارنة مع تأثير واسع النطاق التي تسببها التلاعب التجريبية أخرى مثل الحقن النظامية، microdialysis أو استخدام تقنيات علم البصريات الوراثي. عادة، يتم استخدام التكوين القطب أصبع الظهير 14،15 لتسجيل وقت واحد الخلايا العصبية المستهدفة وتسليم المواد neuroactive من الفائدة. وهو يتألف من القطب تسجيل تعلق على ماصة multibarrel الذي يحمل المواد neuroactive. تعديلات سوقد تم تنفيذ الإجراء riginal التي وصفها Havey وكاسباري 14. على سبيل المثال، التنغستن القطب، بدلا من كوب واحد، ويمكن استخدامها لتسجيل النشاط العصبي 16. الطرق التي تم نشرها مسبقا لتصنيع أقطاب التنغستن 17،18 تنطوي على ثلاث خطوات عامة: النقش كهربائيا من النصائح سلك التنغستن، عزل الزجاج، وتعديل التعرض طرف لتلبية متطلبات التسجيل.حقل مثيرة للاهتمام وطارئة في علم الأعصاب السمعية هو دراسة التحفيز محدد التكيف (SSA 19). SSA هو انخفاض معين في الاستجابة العصبية للأصوات المتكررة التي لا التعميم إلى أصوات أخرى، ونادرا ما قدمت. أهمية SSA تكمن في دوره المحتمل بوصفه آلية العصبية كشف الانحراف الكامن في الدماغ السمعي، وكذلك من الممكن إلى المترابطة الخلايا العصبية لعنصر عدم تطابق السلبية الراحل السمعية أثار المحتملين 20،21. SSA سccurs من IC تصل إلى القشرة السمعية 19،22-24. وقد تجلى GABA A تثبيط بوساطة ليكون بمثابة آلية السيطرة على منطقة أفريقيا جنوب الصحراء 7،16،25، التي ثبت أيضا أن تتأثر التخدير 26. هنا نقدم البروتوكول الذي يجمع بين الأساليب المذكورة سابقا لتسجيل نشاط وحدة واحدة من الخلايا العصبية IC قبل وأثناء تطبيق خصم الانتقائي لل-receptors GABA (أ) في الفئران مستيقظا. أولا، نحن تصف صناعة أقطاب كهربائية أصبع الظهير والقادم، والأساليب الجراحية والتسجيل. لاختبار فعالية إطلاق المخدرات، قارنا مجال تقبلا فضلا عن مستوى منطقة أفريقيا جنوب الصحراء من الخلايا العصبية IC قبل وأثناء طرد microiontophoretic من gabazine.
Protocol
Representative Results
Discussion
وmicroiontophoresis المواد neuroactive في الحيوانات المستيقظة هي تقنية قوية لتحقيق وتشريح دور مدخلات متشابك محددة على نشاط الخلايا العصبية واحدة 40،41. الأهم من ذلك، هذا الإجراء يسمح بتحديد تأثير الناقلات العصبية وneuromodulators على الدوائر العصبية دون أي تشويش محتمل من التخدير. ه?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا المشروع تم تمويله من قبل MINECO يمنح BFU201343608 ف وPSI2013-49348-EXP، ومنحة SA343U14 JCYL لتمويل MSM وMRC الأساسية لARP. عقدت YAA على CONACYT (216106) وزمالة سبتمبر
Materials
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
Referências
- Harris, K. D., Thiele, A. Cortical state and attention. Nat Rev Neurosci. 12 (9), 509-523 (2011).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
- Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Frohlich, F. Awake vs. anesthetized: layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
- Haider, B., Hausser, M., Carandini, M. Inhibition dominates sensory responses in the awake cortex. Nature. 493 (7430), 97-100 (2013).
- Rudolph, M., Pospischil, M., Timofeev, I., Destexhe, A. Inhibition determines membrane potential dynamics and controls action potential generation in awake and sleeping cat cortex. J Neurosci. 27 (20), 5280-5290 (2007).
- Buran, B. N., von Trapp, G., Sanes, D. H. Behaviorally gated reduction of spontaneous discharge can improve detection thresholds in auditory cortex. J Neurosci. 34 (11), 4076-4081 (2014).
- Duque, D., Malmierca, M. S., Caspary, D. M. Modulation of stimulus-specific adaptation by GABA(A) receptor activation or blockade in the medial geniculate body of the anaesthetized rat. J Physiol. 592, 729-743 (2014).
- Stone, T. W. . Microiontophoresis and Pressure Ejection. , (1985).
- Lalley, P. M., Windhorst, U., Johansson, H. . Modern techniques in neuroscience research). , 193-212 (1999).
- Foeller, E., Celikel, T., Feldman, D. E. Inhibitory sharpening of receptive fields contributes to whisker map plasticity in rat somatosensory cortex. J Neurophysiol. 94 (6), 4387-4400 (2005).
- Foeller, E., Vater, M., Kossl, M. Laminar analysis of inhibition in the gerbil primary auditory cortex. J Assoc Res Otolaryngol. 2 (3), 279-296 (2001).
- Kurt, S., Crook, J. M., Ohl, F. W., Scheich, H., Schulze, H. Differential effects of iontophoretic in vivo application of the GABA(A)-antagonists bicuculline and gabazine in sensory cortex. Hear Res. 212 (1-2), 224-235 (2006).
- Sivaramakrishnan, S., et al. GABA(A) synapses shape neuronal responses to sound intensity in the inferior colliculus. J Neurosci. 24 (21), 5031-5043 (2004).
- Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing ‘piggy-back’ multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 48 (2), 249-251 (1980).
- Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses. J Vis Exp. (71), e4358 (2013).
- Perez-Gonzalez, D., Hernandez, O., Covey, E., Malmierca, M. S. GABA(A)-Mediated Inhibition Modulates Stimulus-Specific Adaptation in the Inferior Colliculus. PLoS ONE. 7 (3), e34297 (2012).
- Bullock, D. C., Palmer, A. R., Rees, A. Compact and easy-to-use tungsten-in-glass microelectrode manufacturing workstation. Med Biol Eng Comput. 26 (6), 669-672 (1988).
- Sugiyama, K., Dong, W. K., Chudler, E. H. A simplified method for manufacturing glass-insulated metal microelectrodes. J Neurosci Methods. 53 (1), 73-80 (1994).
- Ulanovsky, N., Las, L., Nelken, I. Processing of low-probability sounds by cortical neurons. Nat Neurosci. 6 (4), 391-398 (2003).
- Escera, C., Malmierca, M. S. The auditory novelty system: An attempt to integrate human and animal research. Psychophysiology. 51 (2), 111-123 (2014).
- Malmierca, M. S., Sanchez-Vives, M. V., Escera, C., Bendixen, A. Neuronal adaptation, novelty detection and regularity encoding in audition. Front Syst Neurosci. 8, 111 (2014).
- Malmierca, M. S., Cristaudo, S., Perez-Gonzalez, D., Covey, E. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the anesthetized rat. J Neurosci. 29 (17), 5483-5493 (2009).
- Antunes, F. M., Nelken, I., Covey, E., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the auditory thalamus of the anesthetized rat. PLoS ONE. 5 (11), 14071 (2010).
- von der Behrens, W., Bauerle, P., Kossl, M., Gaese, B. H. Correlating stimulus-specific adaptation of cortical neurons and local field potentials in the awake rat. J Neurosci. 29 (44), 13837-13849 (2009).
- Perez-Gonzalez, D., Malmierca, M. S. Variability of the time course of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 107 (2012).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Struct Funct. , (2014).
- Merrill, E. G., Ainsworth, A. Glass-coated platinum-plated tungsten microelectrodes. Med Biol Eng. 10 (5), 662-672 (1972).
- Ainsworth, A., Dostrovsky, J. O., Merrill, E. G., Millar, J. An improved method for insulating tungsten micro-electrodes with glass [proceedings]. J Physiol. 269 (1), 4-5 (1977).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178 (1), 75-79 (2009).
- Portfors, C. V., Roberts, P. D., Jonson, K. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neurociência. 162 (2), 486-500 (2009).
- Portfors, C. V., Mayko, Z. M., Jonson, K., Cha, G. F., Roberts, P. D. Spatial organization of receptive fields in the auditory midbrain of awake mouse. Neurociência. 193, 429-439 (2011).
- Muniak, M. A., Mayko, Z. M., Ryugo, D. K., Portfors, C. V. Preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers. J Vis Exp. (64), (2012).
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
- Malmierca, M. S., et al. A discontinuous tonotopic organization in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 28 (18), 4767-4776 (2008).
- Izquierdo, M. A., Gutierrez-Conde, P. M., Merchan, M. A., Malmierca, M. S. Non-plastic reorganization of frequency coding in the inferior colliculus of the rat following noise-induced hearing loss. Neurociência. 154 (1), 355-369 (2008).
- Palmer, A. R., Shackleton, T. M., Sumner, C. J., Zobay, O., Rees, A. Classification of frequency response areas in the inferior colliculus reveals continua not discrete classes. J Physiol. 591 (16), 4003-4025 (2013).
- Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation and deviance detection in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 89 (2013).
- Duque, D., Perez-Gonzalez, D., Ayala, Y. A., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Topographic distribution, frequency, and intensity dependence of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 32 (49), 17762-17774 (2012).
- Ayala, Y. A., Perez-Gonzalez, D., Duque, D., Nelken, I., Malmierca, M. S. Frequency discrimination and stimulus deviance in the inferior colliculus and cochlear nucleus. Front Neural Circuits. 6, 119 (2013).
- Perkins, M. N., Stone, T. W. In vivo release of [3H]-purines by quinolinic acid and related compounds. Br J Pharmacol. 80 (2), 263-267 (1983).
- Lalley, P. M., Windhorst, U., Johansson, H. . Modern Techniques in Neuroscience Research. , 193-212 (1999).
- Candy, J. M., Boakes, R. J., Key, B. J., Worton, E. Correlation of the release of amines and antagonists with their effects. Neuropharmacology. 13 (6), 423-430 (1974).
- Martins, A. R., Froemke, R. C. Coordinated forms of noradrenergic plasticity in the locus coeruleus and primary auditory cortex. Nat Neurosci. , (2015).
- LeBeau, F. E., Rees, A., Malmierca, M. S. Contribution of GABA- and glycine-mediated inhibition to the monaural temporal response properties of neurons in the inferior colliculus. Journal of Neurophysiology. 75 (2), 902-919 (1996).
- Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Cholinergic modulation of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. The Journal of Neuroscience. 35 (35), 12261-12272 (2015).
