Apresentamos métodos para a construção de eletrodos para registrar simultaneamente a atividade neural extracelular e liberar múltiplas substâncias neuroativas nas proximidades dos locais de registro em camundongos acordados. Esta técnica permite a análise detalhada de entradas sinápticas locais putativas para o neurônio de interesse.
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Artigo de método
Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake
Neste artigo
Resumo
Resumo
Diferenças na atividade de neurotransmissores e neuromoduladores e, consequentemente, diferentes respostas neurais, podem ser encontrados entre os animais anestesiados e acordado. Assim, os métodos que permitem a manipulação de sistemas sinápticas em animais acordados são necessários a fim de determinar a contribuição de entradas sinápticas neuronais de processamento afectada pelos anestésicos. Aqui, nós apresentamos metodologia para a construção de eléctrodos para gravar, simultaneamente, actividade neuronal extracelular e libertar várias substâncias neuroactivos na vizinhança dos locais de gravação em ratos despertos. Ao combinar estes procedimentos, foram realizadas injeções microiontophoretic de gabazine para bloquear seletivamente receptores GABA A em neurônios do colículo inferior de ratos conteve-cabeça. Gabazine modificado com sucesso as propriedades da resposta neural, tais como a área de resposta a frequência e adaptação específica do estímulo. Assim, demonstra-se que os nossos métodos são adequados para recording atividade de unidade única e para dissecar o papel dos receptores de neurotransmissores específicos no processamento auditivo.
A principal limitação do processo descrito é o tempo de gravação relativamente curto (~ 3 h), o qual é determinado pelo nível de habituação do animal para as sessões de gravação. Por outro lado, várias sessões de gravação pode ser realizada no mesmo animal. A vantagem desta técnica em relação a outros procedimentos experimentais utilizados para manipular o nível da neurotransmissão ou neuromodulação (tais como injecções sistémicas ou a utilização de modelos optogenetic), é que o efeito do fármaco está confinada às entradas sinápticas locais para o neurónio alvo. Além disso, o costume-fabricação de eléctrodos permite o ajuste dos parâmetros específicos de acordo com a estrutura neural e tipo de neurónio de interesse (tais como a resistência de ponta para melhorar a relação sinal-ruído dos registos).
Introdução
A interacção da excitação neural e inibição é fundamental para o processamento da informação sensorial 1. Sabe-se também que a anestesia tem um forte impacto sobre a dinâmica de activação cortical e do padrão temporal de entradas sinápticas 2,3. Por exemplo, tem-se observado que os anestésicos alterar a duração das respostas visuais evocados nos neurónios corticais 3,4. Além disso, a relação entre as entradas excitatórios e inibidores sinápticas é diferente em animais anestesiados e desperto 4,5, alterando ambos evocados e as taxas de actividade espontânea 6,7. Ao medir as condutâncias sinápticas, Haider e colega....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais foram realizados na Universidade de Salamanca com a aprovação, e usando métodos em conformidade com as normas de uma Universidade do Comitê Animal Care Salamanca, bem como as normas da União Europeia (Directiva 2010/63 / UE) para o uso de animais em pesquisas de neurociência.
1. eléctrodos de tungsténio
Nota: O fabrico de eléctrodos de tungsténio baseia-se na técnica original descrita na Merrill e Ainsworth 27 e Ainsworth et al 28 e realizada usando a configuração de estação de trabalho descrita no Bullock et al, 17...
- Para gravar a atividade ex....
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Resultados
Registramos a atividade-única unidade de 4 neurônios bem isoladas do IC. As relações típicas de sinal-para-ruído obtidos durante gravações extracelulares em ratos despertos são mostrados na Figura 3B. A Figura 4A mostra a área da resposta de frequência (FRA) de cada neurónio, antes e durante o bloqueio do receptor GABA A receptores com gabazine. Observou-se um aumento na força da resposta (picos / estímulo), bem como um alargamento .......
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Discussão
O microiontophoresis de substâncias neuroativos em animais acordados é uma técnica poderosa para sondar e dissecar o papel de entradas sinápticas específicas sobre a atividade de neurônios individuais 40,41. Mais importante ainda, este procedimento permite a determinação do impacto dos neurotransmissores e neuromoduladores nos circuitos neurais sem o potencial de interferência de anestésicos. Aqui, demonstramos que a aplicação de gabazine no IC de ratos acordados robustamente mudou a sintonia de frequência
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este projecto foi financiado pela MINECO concede BFU201343608-P e PSI2013-49348-EXP, eo SA343U14 concessão JCYL ao financiamento HSH e MRC núcleo para ARP. YAA realizou uma CONACyT (216.106) e uma bolsa de setembro
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fio de tungstênio | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 polegadas x 3 polegadas |
| Capilar de vidro borosilicato | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Parede padrão de borosilicato sem filamento, 1,5 mm OD, 0,86 mm ID, 100 mm de comprimento |
| Capilares de vidro multibarril | Instrumentos de Precisão Mundial | 5B120F-4 | Capilar de 5 cilindros, 4 polegadas de comprimento, 1,2 mm OD, com filamento |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Adesivo fotopolimerizável, usado para prender o eletrodo de tungstênio à pipeta multibarril de vidro |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Adesivo fotopolimerizável, usado para prender o espigão ao crânio do animal |
| Carisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Compósito fotopolimerizável, usado para reforçar a ligação do espigão com o crânio |
| Araldit Cristal | Ceys | , usado para fixar ainda mais a fixação do eletrodo de tungstênio à pipeta multibarril de vidro | |
| Incluindo bombas de iontoforese IP-2 (uma para cada canal de administração de medicamentos) e um módulo de equilíbrio | |||
| Extrator de pipetas de vidro multibarril | Lâmpada LED Narishige | Modelo PE-21 | |
| Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm | |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Agulha plástica flexível, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Cetamina, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µ l de 20 mM de gabazina em água destilada e ajustar o pH para 4 |
Referências
- Harris, K. D., Thiele, A. Cortical state and attention. Nat Rev Neurosci. 12 (9), 509-523 (2011).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
- Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J.....
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Reimpressões e permissões
