Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake
Summary
We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.
Abstract
Le differenze dell'attività di neurotrasmettitori e neuromodulatori, e di conseguenza diverse risposte neurali, si può rinvenire tra animali anestetizzati e sveglio. Pertanto, i metodi che consentono la manipolazione dei sistemi sinaptiche in animali svegli sono necessari al fine di determinare il contributo degli ingressi sinaptici al trattamento neuronale influenzata da anestetici. Qui, presentiamo metodologia per la realizzazione di elettrodi per registrare simultaneamente attività neurale extracellulare e rilasciare più sostanze neuroattive in prossimità dei siti di registrazione in topi sveglio. Grazie alla combinazione di queste procedure, abbiamo effettuato iniezioni microiontophoretic di gabazine per bloccare selettivamente i recettori GABA A nei neuroni del collicolo inferiore di topi testa-trattenuto. Gabazine modificato con successo proprietà di risposta neurale come l'area risposta in frequenza e l'adattamento specifico per stimolo. Così, abbiamo dimostrato che i nostri metodi sono adatti per Recording attività singola unità e per sezionare il ruolo dei recettori del neurotrasmettitore specifici in elaborazione uditiva.
La limitazione principale della procedura descritta è il tempo di registrazione relativamente breve (~ 3 ore), che è determinato dal livello di assuefazione dell'animale alle sessioni di registrazione. D'altro canto, più sessioni di registrazione possono essere eseguite nello stesso animale. Il vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre procedure sperimentali utilizzate per manipolare il livello della neurotrasmissione o neuromodulation (come iniezioni sistemici o l'uso di modelli optogenetic), è che l'effetto del farmaco si limita agli ingressi sinaptici locali al neurone bersaglio. Inoltre, la misura fabbricazione di elettrodi permette la regolazione di parametri specifici in base alla struttura neurale e tipo di neurone di interesse (ad esempio la resistenza suggerimento per migliorare il rapporto segnale-rumore delle registrazioni).
Introduction
L'interazione tra l'eccitazione e l'inibizione neuronale è fondamentale per l'elaborazione delle informazioni sensoriali 1. È anche noto che l'anestesia ha un forte impatto sulla dinamica di attivazione corticale e il pattern temporale degli ingressi sinaptici 2,3. Ad esempio, è stato osservato che gli anestetici alterano la durata di risposte visivamente evocati nei neuroni corticali 3,4. Inoltre, il rapporto tra eccitatori e gli ingressi sinaptici inibitori è diverso in animali anestetizzati e svegli 4,5, alterando sia evocata e tassi di attività spontanee 6,7. Misurando le conduttanze sinaptiche, Haider e colleghi hanno scoperto che l'inibizione 4 abbinato eccitazione in ampiezza in anestesia mentre durante la veglia, l'inibizione era più forte di eccitazione. Questi risultati inducono lo sviluppo di procedure sperimentali per studiare l'impatto degli ingressi sinaptici specifiche sulla elaborazione sensoriale in animali svegli.
<p class = "jove_content"> L'espulsione controllato di sostanze neuroattivi cariche applicando piccole iniezioni di corrente (dell'ordine di nA) è stato ampiamente utilizzato per studiare il contributo degli ingressi sinaptici e il ruolo dei recettori delle cellule putativi in elaborazione sensoriale 8-13 . Questa tecnica, nota come microiontophoresis, consente l'applicazione di farmaci in prossimità del neurone registrato, che contribuisce ad un rapido effetto e confinato. Questa procedura è più adatto per studiare effetti locali di sostanze neuroattivi, rispetto all'effetto diffusa suscitata da altre manipolazioni sperimentali come iniezioni sistemiche, microdialisi o l'uso di tecniche optogenetic. Di solito, una configurazione degli elettrodi piggy-back 14,15 viene utilizzato per registrare contemporaneamente il neurone bersaglio e fornire i sostanze neuroattivi di interesse. È costituita da un elettrodo di registrazione collegato a una pipetta multibarrel che trasporta le sostanze neuroattivi. Modifiche del oProcedura riginal descritta da Havey e Caspary 14 sono state attuate. Ad esempio, un elettrodo di tungsteno, invece di un vetro, può essere utilizzato per registrare l'attività neurale 16. Metodi precedentemente pubblicati per la fabbricazione di elettrodi di tungsteno 17,18 coinvolgono tre fasi generali: incisione elettrolitica di consigli filo di tungsteno, vetro isolante, e la regolazione dell'esposizione punta a soddisfare i requisiti di registrazione.Un campo interessante ed emergente nel campo delle neuroscienze uditivo è lo studio di adattamento specifiche stimolo (SSA 19). SSA è una diminuzione specifica nella risposta neurale a suoni ripetitivi che non generalizzano ad altri suoni, raramente presentati. L'importanza di SSA risiede nel suo ruolo potenziale di rilevamento devianza sottostante meccanismo neurale nel cervello uditivo, così come una possibile correlato neuronale per la componente tardiva disallineamento negatività uditivo potenziali evocati 20,21. SSA occurs dalla IC fino alla corteccia uditiva 19,22-24. GABA A inibizione mediata ha dimostrato di agire come un meccanismo di controllo di guadagno su SSA 7,16,25, che è stato anche dimostrato di essere colpiti da anestesia 26. Qui vi presentiamo un protocollo che combina i metodi descritti in precedenza per registrare l'attività singola unità di neuroni IC prima e durante l'applicazione di un antagonista selettivo dei recettori GABA A nei topi sveglio. In primo luogo, si descrive la fabbricazione di elettrodi piggy-back e il prossimo, i metodi chirurgici e di registrazione. Per verificare l'efficacia di rilascio del farmaco, abbiamo confrontato campo recettivo così come il livello di SSA di neuroni IC prima e durante l'espulsione microiontophoretic di gabazine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il microiontophoresis di sostanze neuroattivi in animali svegli è una tecnica potente per sondare e sezionare il ruolo degli ingressi sinaptici specifici per l'attività di singoli neuroni 40,41. Ancora più importante, questa procedura permette di determinare l'impatto dei neurotrasmettitori e neuromodulatori su circuiti neurali senza l'interferenza potenziale di anestetici. Qui, dimostriamo che l'applicazione gabazine nel IC di topi svegli robusta cambiato la frequenza di sintonizzazione <s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato dalla MINECO concede BFU201343608-P e PSI2013-49348-EXP, e la concessione SA343U14 JCYL al finanziamento di base MSM e MRC di ARP. YAA tenuto una CONACYT (216106) e una borsa di studio settembre
Materials
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
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