Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake
Summary
We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.
Abstract
Diferenças na atividade de neurotransmissores e neuromoduladores e, consequentemente, diferentes respostas neurais, podem ser encontrados entre os animais anestesiados e acordado. Assim, os métodos que permitem a manipulação de sistemas sinápticas em animais acordados são necessários a fim de determinar a contribuição de entradas sinápticas neuronais de processamento afectada pelos anestésicos. Aqui, nós apresentamos metodologia para a construção de eléctrodos para gravar, simultaneamente, actividade neuronal extracelular e libertar várias substâncias neuroactivos na vizinhança dos locais de gravação em ratos despertos. Ao combinar estes procedimentos, foram realizadas injeções microiontophoretic de gabazine para bloquear seletivamente receptores GABA A em neurônios do colículo inferior de ratos conteve-cabeça. Gabazine modificado com sucesso as propriedades da resposta neural, tais como a área de resposta a frequência e adaptação específica do estímulo. Assim, demonstra-se que os nossos métodos são adequados para recording atividade de unidade única e para dissecar o papel dos receptores de neurotransmissores específicos no processamento auditivo.
A principal limitação do processo descrito é o tempo de gravação relativamente curto (~ 3 h), o qual é determinado pelo nível de habituação do animal para as sessões de gravação. Por outro lado, várias sessões de gravação pode ser realizada no mesmo animal. A vantagem desta técnica em relação a outros procedimentos experimentais utilizados para manipular o nível da neurotransmissão ou neuromodulação (tais como injecções sistémicas ou a utilização de modelos optogenetic), é que o efeito do fármaco está confinada às entradas sinápticas locais para o neurónio alvo. Além disso, o costume-fabricação de eléctrodos permite o ajuste dos parâmetros específicos de acordo com a estrutura neural e tipo de neurónio de interesse (tais como a resistência de ponta para melhorar a relação sinal-ruído dos registos).
Introduction
A interacção da excitação neural e inibição é fundamental para o processamento da informação sensorial 1. Sabe-se também que a anestesia tem um forte impacto sobre a dinâmica de activação cortical e do padrão temporal de entradas sinápticas 2,3. Por exemplo, tem-se observado que os anestésicos alterar a duração das respostas visuais evocados nos neurónios corticais 3,4. Além disso, a relação entre as entradas excitatórios e inibidores sinápticas é diferente em animais anestesiados e desperto 4,5, alterando ambos evocados e as taxas de actividade espontânea 6,7. Ao medir as condutâncias sinápticas, Haider e colegas 4 descobriu que a inibição de excitação combinado em amplitude sob anestesia que, durante a vigília, a inibição foi mais forte do que a excitação. Estas descobertas solicitar o desenvolvimento de procedimentos experimentais para estudar o impacto de entradas sinápticas específicas no processamento sensorial em animais acordados.
<p class = "jove_content"> A ejeção controlada de substâncias neuroativos cobradas pela aplicação de pequenas injeções atuais (da ordem de nA) tem sido amplamente utilizada para estudar a contribuição de entradas sinápticas eo papel dos receptores celulares putativos no processamento sensorial 8-13 . Esta técnica, conhecida como microiontophoresis, permite a aplicação de medicamentos na vizinhança do neurónio gravada, a qual contribui para um efeito rápido e confinado. Este procedimento é mais apropriado para estudar os efeitos locais de substâncias neuroactivos, em comparação com o efeito generalizado provocado por outras manipulações experimentais, tais como injecções sistémicas, microdiálise ou a utilização de técnicas de optogenetic. Normalmente, uma configuração de eletrodo piggy-back 14,15 é usado para gravar simultaneamente o neurônio alvo e entregar as substâncias neuroativos de interesse. É constituída por um eléctrodo de registo ligada a uma pipeta multibarrel que transporta as substâncias neuroactivos. Modificações do oprocedimento riginal descrito por Havey e Caspary 14 foram implementadas. Por exemplo, um eléctrodo de tungsténio, em vez de um vidro, pode ser utilizado para registar a actividade neuronal 16. Métodos publicados anteriormente para o fabrico de eléctrodos de tungsténio 17,18 envolve três etapas gerais: ataque eletrolítico de pontas de fio de tungstênio, isolamento de vidro, e o ajuste da exposição ponta para satisfazer as necessidades de gravação.Um campo interessante e emergentes em neurociência auditiva é o estudo de adaptação específicas de estímulo (SSA 19). SSA é uma diminuição específica na resposta neural para sons repetitivos que não generaliza para outros sons, raramente apresentados. A importância da SSA reside no seu papel potencial como um mecanismo de detecção de desvio neural subjacente no cérebro auditivo, bem como uma possível correlação neuronal para o componente incompatibilidade negatividade tardia do potencial evocado auditivo 20,21. SSA occurs do IC, até o córtex auditivo 19,22-24. A inibição mediada por GABA tem sido demonstrada para actuar como um mecanismo de controlo de ganho no SSA 7,16,25, que também tem sido mostrado a ser afectado por anestesia 26. Aqui apresenta-se um protocolo que combina métodos anteriormente descritos para gravação a actividade de uma única unidade do neurónios IC antes e durante a aplicação de um antagonista selectivo dos receptores de GABAA em ratos despertos. Em primeiro lugar, descrevemos a fabricação de eletrodos piggy-back e no próximo, os métodos cirúrgicos e de gravação. Para testar a eficácia da libertação do fármaco, foi comparado o campo receptivo, bem como o nível de SSA de neurónios IC antes e durante a ejecção de microiontophoretic gabazine.
Protocol
Representative Results
Discussion
O microiontophoresis de substâncias neuroativos em animais acordados é uma técnica poderosa para sondar e dissecar o papel de entradas sinápticas específicas sobre a atividade de neurônios individuais 40,41. Mais importante ainda, este procedimento permite a determinação do impacto dos neurotransmissores e neuromoduladores nos circuitos neurais sem o potencial de interferência de anestésicos. Aqui, demonstramos que a aplicação de gabazine no IC de ratos acordados robustamente mudou a sintonia de f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto foi financiado pela MINECO concede BFU201343608-P e PSI2013-49348-EXP, eo SA343U14 concessão JCYL ao financiamento HSH e MRC núcleo para ARP. YAA realizou uma CONACyT (216.106) e uma bolsa de setembro
Materials
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
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