깨어 마우스의 신경 활성 물질의 Microiontophoretic 응용 프로그램과 결합하여 신경 활동의 세포 외 기록
1Auditory Neuroscience Laboratory, Institute of Neuroscience of Castilla y León,University of Salamanca, 2Neural Systems Laboratory, Institute for Systems Research,University of Maryland, 3Medical Research Council Institute of Hearing Research, 4Department of Cell Biology and Pathology, Faculty of Medicine,University of Salamanca
Summary
We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.
Abstract
신경 전달 물질과 신경 조절, 결과적으로 다른 신경 반응의 활성의 차이는 마취 웨이크 동물 사이에서 발견 될 수있다. 따라서, 웨이크 동물의 시냅스 시스템의 조작을 허용하는 방법에 의해 영향을받지 마취제 신경 처리 시냅스 입력의 기여도를 결정하기 위해 요구된다. 여기서는 동시에 신경 세포 활성을 기록하고 깨어 마우스에서의 기록 위치의 근방에 여러 신경 활성 물질을 방출하는 전극의 구성에 대한 방법을 제시한다. 이 절차를 결합함으로써, 우리는 선택적으로 머리를 억제 마우스의 열등한 둔덕의 뉴런에서 GABA A를 수용체를 차단하는 gabazine의 microiontophoretic 주사를 시행 하였다. Gabazine는 성공적 주파수 응답 영역과 자극 특정 적응 같은 신경 응답 특성을 개질. 따라서, 우리는 우리의 방법이 recordin에 적합하다는 것을 입증g 단일 유닛 활동 및 청각 처리에서 특정한 신경 전달 물질 수용체의 역할에 대한 해부.
상술 한 절차의 주요 한계는 기록 세션 동물의 습관화의 레벨에 의해 결정되는 상대적으로 짧은 기록 시간 (~ 3 시간)이다. 한편, 복수의 기록 세션은 동일한 동물에서 수행 될 수있다. 신경 전달하거나 (예컨대 전신 주사 또는 optogenetic 모델의 사용 등) neuromodulation 레벨을 조작하는 데 사용되는 다른 실험 절차를 통해이 기술의 이점은 약물의 효과는 표적 뉴런 로컬 시냅스 입력에 한정된다는 점이다. 또한, 전극의 주문 제작은 신경 구조 (예 레코딩의 신호 대 잡음비를 향상시키는 팁 저항과 같은) 관심있는 신경 세포의 종류에 따라 특정의 파라미터 조정을 허용한다.
Introduction
신경 자극과 억제의 상호 작용은 감각 정보 (1)의 처리를 위해 필수적입니다. 또한 마취 피질 활성화 및 2,3- 시냅스 입력의 시간적 패턴의 역학에 강한 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 예를 들면, 마취제는 피질 뉴런 3,4-에서 시각 유발 반응의 지속 기간을 변경하는 것이 관찰되었다. 또한, 흥분 및 억제 성 시냅스 입력 사이의 비율이 모두 유발 변경 및 운동량 속도 -6,7- 마취 깨어 동물 4,5- 다르다. 각성시, 억제가 여기보다 더 강한 반면 시냅스 컨덕턴스를 측정함으로써, 하이더와 동료 4 마취 진폭이 억제 일치 여기를 발견했다. 이러한 결과는 웨이크 동물의 감각 처리 시냅스 특정 입력의 효과를 연구하기 위해 실험 절차의 개발 프롬프트.
<P 클래스 = "jove_content"> (NA 정도의) 작은 전류 주사를인가함으로써 대전 신경 활성 물질의 제어 방출 광범위 시냅스 입력 기여 감각 처리 8-13에서 추정되는 세포 수용체의 역할을 연구하기 위해 사용되어왔다 . microiontophoresis 알려진 이러한 기술은 신속하고 밀폐 효과에 기여하는 기록 된 뉴런의 근방에서 약물의 적용을 허용한다. 이 절차는 전신 주사, 미세 투석 또는 optogenetic 기술의 사용과 같은 다른 실험 조작에 의해 유도 광범위한 효과에 비해 신경 활성 물질의 국소 효과를 연구하는데 더욱 적합하다. 일반적으로 피기 백 전극 구성 14,15 동시에 표적 뉴런 기록 관심있는 신경 활성 물질을 전달하는 데 사용된다. 그것은 신경 활성 물질을 운반하는 multibarrel 피펫에 부착 된 기록 전극으로 구성되어 있습니다. 오의 수정Havey 및 CASPARY (14)에 의해 설명 riginal 절차를 구현하고있다. 예를 들어, 텅스텐 전극 대신에 유리 하나, 신경 활성 (16)을 기록하는데 사용될 수있다. 기록 요건을 충족하는 텅스텐 와이어 팁, 유리 절연 및 팁 노출 조정 전해 에칭 : 텅스텐 전극 (17, 18)의 제조 이전에 게시 된 방법은 일반적으로 세 가지 단계를 포함한다.청각 신경 과학에 흥미와 응급 필드 자극 특정 적응 (SSA 19)의 연구이다. SSA는 다른, 거의 제시하지 소리를 일반화하지 않는 반복적 인 소리에 신경 응답의 특정 감소이다. SSA의 중요성을 유발 전위 20,21 청각 뇌 신경 메커니즘 기본 일탈 검출뿐만 아니라 청각 늦은 불일치 부정적 요소에 대한 가능한 신경 상관 관계로서 잠재적 역할에있다. SSA 오청각 피질 19,22-24까지 IC에서 ccurs. GABA – 매개 억제는 마취 (26)에 의해 영향을받는 것으로 밝혀졌다 SSA 7,16,25에 이득 제어 메커니즘 역할을하는 것으로 입증되었다. 여기에서는 전에 웨이크 생쥐에서 GABA의 -receptors의 선택적 길항제의인가 중에 IC 뉴런의 단일 유닛 활동을 기록하기위한 전술 한 방법을 결합하는 프로토콜을 제시한다. 첫째, 우리는 피기 백 전극과 다음, 수술 및 기록 방법의 제조에 대해 설명합니다. 약물 방출의 효능을 테스트하기 위해, 우리는 수용 필드뿐만 아니라 전 gabazine의 microiontophoretic 배출시 IC 뉴런의 SSA의 수준을 비교했다.
Protocol
모든 실험 절차의 승인 살라망카 대학에서 수행하고 있었다의 기준에 부합하는 방법을 사용하여, 살라망카 동물 관리위원회의 대학뿐만 아니라 유럽 연합 (EU)의 기준 (지침 63분의 2,010 / EU)에 대한 신경 연구에서 동물의 용도. 1. 텅스텐 전극 주 :. 텅스텐 전극의 제조 및 메릴 워스 27 워스 외 (28)에서 설명한 기존의 기술에 기초하여 수소 등 17에</s…
Representative Results
우리는 IC의 4 잘 격리 된 신경 세포의 단일 유닛 활동을 기록했다. 웨이크 마우스 세포 외 기록시 얻어진 전형적인 신호대 잡음비는도 3b에 도시된다.도 4a는 전 및 GABA (A)의 봉쇄 gabazine으로 -receptors 동안 각 뉴런의 주파수 응답 영역 (FRA)을 나타낸다. 반응 강도 (스파이크 / 자극)뿐만 아니라 스펙트럼 조정의 폭이 넓어의 증가가 관찰되었다…
Discussion
깨어있는 동물의 신경 활성 물질의 microiontophoresis는 프로브 및 단일 뉴런 40, 41의 활동에 특정 시냅스 입력의 역할을 해부 할 수있는 강력한 기술이다. 더 중요한 것은,이 절차는 마취제의 잠재적 인 간섭없이 신경 회로의 신경 전달 물질과 신경 조절의 영향의 결정을 할 수 있습니다. 여기서는 웨이크 마우스의 IC에 gabazine의인가 견고 주파수 튜닝 (도 4A)에서, 시간 응답 패턴 <s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MINECO에 의해 투자 된이 프로젝트는 BFU201343608-P 및 PSI2013-49348-EXP 및 ARP에 MSM 및 MRC 핵심 자금 조달에 JCYL 부여 SA343U14을 부여합니다. YAA은 CONACYT (216106)와 9월의 교제를 개최했다.
Materials
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
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Citar este artigo
Ayala, Y. A., Pérez-González, D., Duque, D., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice. J. Vis. Exp. (111), e53914, doi:10.3791/53914 (2016).