Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
سرطان الثدي هو من بين الأورام الخبيثة الأكثر شيوعا التي تؤثر على السكان الإناث في جميع أنحاء العالم. وذكرت أكثر من 1.3 مليون حالة إصابة بسرطان الثدي كل عام في جميع أنحاء العالم 1،2. على الرغم من أن الخلايا السرطانية قد تعتبر تقليديا متجانسة من الناحية البيولوجية والتكاثري للغاية، أصبح من الواضح أن سرطان الثدي هو جينيا وغير متجانسة سريريا. مقاومة للعقاقير المضادة للسرطان انتشارا هي السمة المميزة لسرطان الثدي المتقدمة، مما أدى إلى وفيات في الغالبية العظمى من المرضى من خلال تسهيله من تطور السرطان وبعد ورم خبيث 3.
الرنا الميكروية (miRNAs) هي فئة من جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة حوالي 22 النيوكليوتيدات طويلة أن تنظيم التعبير الجيني عن طريق تثبيط عملية الترجمة مرنا أو التوسط مرنا تدهور 4. وقد تم تحديد أكثر من 2000 miRNAs مختلفة حتى الآن في البشر، التي ترتبط الأمراض التي تصيب الإنسان 5. مجموعة متزايدة من الدراسات هفأظهرت الإلكترونية التي miRNAs يمكن أن تعمل كما المسرطنة والمكثفات الورم وغالبا ما dysregulated في الأورام 6. miRNAs تؤثر بشدة كل من تكون الأورام الأولية عن طريق التحكم في الهيئات التنظيمية الرئيسية للتقدم دورة الخلية، الشيخوخة، موت الخلايا المبرمج والالتهام الذاتي، جنبا إلى جنب مع تلك الحركة الخلايا السرطانية، والغزو والانبثاث 7.
ارتبط التعبير شاذ ميرنا أيضا مع الآثار السريرية مثل المرحلة، والتمايز، والتشخيص والاستجابة إلى العلاج المساعد 8. على وجه الخصوص، وزيادة يرتبط ارتباطا مير 146 التعبير مع سوء أحوال الطقس في مرضى سرطان الرئة 9. وقد أثبتت دراسة أخرى أن فقدت التعبير عن ميرنا let7b مرتبط الظواهر الخبيثة، وبالتالي، وضعف البقاء على قيد الحياة 6. فهم أنواع من الخلايا والهياكل التي تعبر عن miRNAs هو جزء مهم من فهم آليات يمكن من خلالها إحداث تغييرات في ميرنا خلية تأثير التعبير والأنسجة الظواهر 10. يتم أخذ بعض miRNAs وجدت أن يفرز في الخلايا اللحمية في الخلايا الظهارية وتعمل خصيصا على أهدافها. في السياق نفسه، تفرز مير 212 و مير-132 التي سدى وتنظيم التفاعلات الظهارية انسجة اللازمة لنمو الأقنية خلال تطوير الغدة الثديية 11. الهدف العام من هذه الورقة هو شرح بروتوكول مفصلة للكشف عن التعبير ميرنا في أنسجة سرطان الثدي من خلال ميرنا في الموقع التهجين. لقد الأمثل جميع الظروف لفحص مستويات التعبير ميرنا-489 في سرطان الثدي عينات المرضى. تحقيقا لهذه الغاية، استخدمنا DIG المسمى مقفل النووي حمض (LNA) التحقيق في تجربتنا. وكان بعض من النيوكليوتيدات لها لتعديل حالات الغدد، وهذا هو، والجسر الذي يربط بين الميثيلين 2 "ذرة أكسجين و 4" ذرة الكربون في العمود الفقري ريبوز الذي يحدد النوكليوتيدات بحيث يبقى "في مكان مغلق" بعد التهجين. ونتيجة لذلك، هو أكثر صعوبةللمجمع المهجنة لتفسد 12،13.
وكان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد مستوى التعبير ميرنا في أنسجة سرطان الثدي باستخدام ميرنا في الموقع التهجين. وتجدر الإشارة إلى أنه في هذه التجربة، وتحسين كل الظروف لأنسجة سرطان الثدي. قد تكون هناك حاجة مزيد من التحسين لأنواع الأنسجة الأخرى. ويجب بذل كل الحلول م?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
ELF-97 | Life technology | E6604 | |
50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |