Analyse clinicopathologique de miRNA expression dans le cancer du sein à l'aide de tissus miRNA<em> In Situ</em> hybridation
Summary
Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.
Abstract
In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.
Introduction
Le cancer du sein est parmi les tumeurs malignes les plus courantes qui touchent la population féminine à travers le monde. Plus de 1,3 millions de cas de cancer du sein sont signalés chaque année dans le monde 1,2. Bien que les cellules tumorales ont été traditionnellement considéré comme biologiquement homogène et hautement prolifératifs, il est devenu évident que le cancer du sein est génétiquement hétérogène et cliniquement. La résistance aux médicaments anti – cancéreux qui prévalent est une caractéristique des cancers du sein avancés, ce qui conduit à la mortalité chez la majorité des patients grâce à la facilitation de la progression du cancer et des métastases 3 minutes.
Les microARN (miARN) sont une classe de petites molécules d' environ 22 nucléotides de long ARN qui régulent l' expression des gènes en bloquant la traduction de l' ARNm ou de médiation ARNm dégradation 4. Plus de 2.000 miARN différents ont jusqu'à présent été identifiés chez l' homme, qui sont liés à des maladies humaines 5. Un tableau croissant d'études VHAe démontré que les miARN peuvent fonctionner comme oncogènes et suppresseurs de tumeurs et sont souvent dérégulée dans les tumeurs 6. miARN incidence fortement tous les tumorigenèse primaires en contrôlant les principaux régulateurs de la progression du cycle cellulaire, de la sénescence, l' apoptose et autophagy, ainsi que ceux de la motilité des cellules tumorales, l' invasion et les métastases 7.
Expression Aberrant miRNA a également été associée à des implications cliniques telles que le stade, la différenciation, le pronostic et la réponse au traitement adjuvant 8. En particulier, l' augmentation de l' expression de miR-146 est corrélée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de cancer du poumon 9. Une autre étude a démontré que l' expression perdue de miARN-let7b est liée à des phénotypes malignes et, par conséquent, une faible survie 6. Comprendre les types de cellules et de structures qui expriment miARN est une partie importante de comprendre les mécanismes à travers lesquels des altérations de miRNA influence d'expression cellulaire ettissus phénotypes 10. Certains miARN révélées être sécrétées dans les cellules stromales sont pris en charge par les cellules épithéliales et agissent spécifiquement sur leurs cibles. Dans la même veine, miR-212 et miR-132 sont sécrétées par stroma et régulent les interactions épithéliales-stromal nécessaires à l' excroissance canalaire au cours du développement de la glande mammaire 11. L'objectif global de cet article est d'expliquer un protocole détaillé pour détecter l' expression de miARN dans les tissus du cancer du sein par miRNA hybridation in situ. Nous avons optimisé toutes les conditions pour tester les niveaux d'expression des miARN-489 dans le cancer du sein des échantillons de patients. À cette fin, nous avons utilisé un DIG marqué verrouillé acide (LNA) sonde nucléique dans notre expérience. Certains de ses nucléotides a eu une modification de LNA, qui est un pont méthylène connectant 'atome d'oxygène et 4 du 2 atome de carbone du squelette ribose qui fixe le nucleotide de telle sorte qu'il reste "bloque" après hybridation. Par conséquent, il est beaucoup plus difficilepour le complexe hybride pour dénaturer 12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le but de cette étude était de déterminer le niveau d'expression de miARN dans les tissus du cancer du sein en utilisant des miARN hybridation in situ. Il convient de noter que dans cette expérience, toutes les conditions sont optimisées pour le tissu du cancer du sein. Une optimisation supplémentaire peut être nécessaire pour d'autres types de tissus. Toutes les solutions doivent être faites avec de l'eau DEPC et tous les conteneurs à utiliser doivent être rincés à l'eau traitée a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.
Materials
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50X Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
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