Protocol
조류 배아는 IUCAC의 규정에 따라 척추 동물로 간주되지 않습니다.
1. 수술에 대한 배아를 얻기
- 80 품어 - 해밀턴과 햄버거 (HH) 단계에서 배아를 얻기 위해 약 72 시간 동안 40 ° C에서 가습 (60 %) 로커 배양기에서 90 수정 된 Bovan 닭고기 달걀 (무딘 끝을 위로하는) (17)에 기반 계란의 정확한 수를 결정 전력 분석 및 배아 (17)의 생존율. 적절한 공기 순환을 허용하도록 배양 플라스틱 계란 트레이를 사용합니다.
- 이 원하는 발달 단계가 달성되면, 100mm X 26mm 페트리 접시에 약 20 ㎖ (중탄산 나트륨 (1g / L)로 보충) 따뜻한 (37 ° C) 타이로드의 버퍼를 붓는다.
- 70 % 에탄올로 달걀 껍질을 소독.
- 조심스럽게 메스 손잡이와 쉘 균열 조심스럽게 타이로드의 버퍼를 포함하는 접시에 그 내용을 공개. 그들은 시각적으로 표시하는 경우 배아 (i)를 폐기 이상 (ⅱ) 그들은오른쪽 발달 단계에서 (ⅲ) 그들은 잘못 노른자 및 / 또는 (ⅳ) 출혈 발생의 방향되지 않습니다. 즉시 개발을 손상하지 않도록 40 ° C에서 비켜 전 배치 후 수술을 실시되지 않은 배아를 유지합니다.
주 : 준비는 해밀턴과 햄버거 (18)에 따라 수행된다. 병아리 태아의 이상은 육안에 의해 절개 범위에 따라 결정된다. 배아는 적절한 폴딩 및 벤딩과 혈관이 있는지 확인합니다.
2. OFT 밴딩
- 하나의 11/0 나일론 수술 봉합사에서 개별 1cm 긴 스레드를 Tweeze과 느슨한 매듭을 형성한다. 모든 예비 성형 노트를 살균 UV.
- 해부 현미경, 시각적으로 심장이 정상 속도 (~ 120 비트 / 분)에 치고되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 배아를 버린다.
- 전송 피펫을 사용하여 배아 표면에 따뜻한 (37 ° C) 타이로드의 버퍼 6 ml의 - 그냥 수술 전, 5를 적용합니다.
- , 공정 거래 청에서 예비 성형 매듭의 한 끝을 통과 OFT / 심실 접합 (OVJ) (또는 원하는 위치)에서 봉합사를 놓고하여 심장을 둘러싸고있는 세포막을 포함하여 OFT을 죄기 매듭으로 끝을 전달합니다.
- 따뜻한 6 ㎖ (37 ° C) 타이로드의 버퍼가 전송 피펫을 사용하여 - 수술 후 5 노른자의 표면을 젖은.
- 제어 태아에게 줄무늬 배아 등 전 비켜을 유지; 그러나 수술에 대상이되지 않습니다.
- 습윤 (60 %) 인큐베이터에서 40 ℃에서 시간의 소정 시간 동안, 배아를 인큐베이션.
- 원하는 시점에 도달하면, 직선 위를 이용 난황에서 배아를 절제. 미세 집게로 심장을 해부 등으로 인해 변경된 혈역학 17 심장 형태의 변화로 여러 하류 연구에 사용합니다.
3. 밴딩 개입이 혈류의 변화를 원인 것을 확인
주 : 밴딩 개입에 의한 부분적인 수축이 OVJ에서 혈류 속도의 증가를 이끈다. 이는 혈역학 파라미터 편리 실험의 목적하는 시점에서 수행되는 2 차원 초음파 영상을 이용하여 평가된다.
- 단일 배아 한번에 이미징 될 수 있기 때문에, 40 ° C의 배양기에서 초음파 영상에 대해 지정된 다른 배아를 유지한다.
- 배아를 포함하는 배양 접시 40 ° C로 설정 가열 패드에 몇 군데에 배치합니다.
- 따뜻한 (37 ° C) 타이로드의 버퍼로, 가장자리까지 접시를 입력합니다. 그대로 노른자를 유지하기 위해 천천히 접시에 완충 용액을 붓는다. 그러나, 난황의 무결성이 단계 동안 손상되는 경우, 배아를 버린다.
- 배아의 중심 축이 조절 스탠드에서 일시 중단되는 초음파 프로브에 수직 인 것을 동양 배아 등.
- 초음파 시스템 오페라팅은 B-모드에서 화면의 박동 심장의 2D 이미지를 획득하고 OFT, 심실과 OVJ 명확하게 볼 수 있습니다 있도록 스테이지 (손 난로)를 이동합니다.
- 원하는 펄스 반복 주파수 (예를 들어, 20 kHz에서)에서, 펄스 파 (PW) 모드로 전환하고 OVJ 정확히 속도 데이터를 얻을 수 있습니다. 심박동의 B 모드 영상이 화면에 얻어진다.
- 공정 거래 청, 심실과 OVJ을 볼 수있는 무대를 이동합니다. 초음파 시스템 소프트웨어를 사용하여 정확하게 OVJ로 속도 측정을 얻었다.
주 : 배아의 심장 박동수는 촬상 동안 감소하면, 얻어진 속도 데이터를 분석을 위해 사용되지 않아야한다. 속도 측정에 사용 된 모든 배아는 바람직하게는 초음파 촬상 후에 다른 실험에 사용되어서는 안된다.
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Representative Results
그림 1은 OFT 밴딩에 필요한 악기를 사용하는 것이 좋습니다. 뚜껑이 덮여 때 배아를 파괴하지 않도록 배아 예를 포함하는 페트리 접시 (도 1a)는 오보 충분히 깊어 야한다. 깊은 배양 접시 (도 1C)는 또한 타이로드의 버퍼의 충분한 양이 난황 위에 붓고 수 있도록 초음파 이미징을 위해 사용되어야한다.
단일 1cm 스레드 (그림 2A)는 11 / 0 나일론 봉합사 (그림 1A)로부터 tweezed과 느슨한 매듭 (그림 1B)로 연결되어 있습니다. 모든 예비 성형 노트는 UV 살균된다. 그림 3a는 수정 된 계란이 원하는 단계까지 배양 가습 로커 실을 보여줍니다. 그림 3b는 줄무늬 및 제어 배아 비켜 예를 유지 배아 인큐베이터를 보여줍니다
도 4a에 도시 된 노른자위 예 오보.도 4b의 위쪽에 HH17 배아는 HH17 배아의 OVJ로 봉합 (밴드)의 위치를 개략적으로 보여주는 도면이다.도 4c는 묘화 줄무늬 배아의 대표 화상은 수술 후 48 시간.
함입 사이트를 통해 혈류 속도에 밴딩 간섭의 효과는 2D 초음파 영상에 의해 측정된다. 예상대로 OVJ의 속도 제어 (도 5)에 상대적인 밴드 배 높다. 최근 OFT 혈류 속도 및 벽 전단 응력 (17) 상에 줄무늬의 영향을 나타내는 24 시간 시점에서 줄무늬 제어 하트 전산 유체 역학 (CFD) 분석을 수행 하였다.
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그림 1. 수술 도구. (A) 11/0 나일론 봉합사. (B) 미리 형성된 매듭을 포함하는 페트리 접시입니다. (C) 예 비켜 배아 문화와 초음파 영상에 대한 깊은 배양 접시. (D) 전송 피펫. (E) 메스는 달걀 껍질 균열 처리합니다. (F) 수술 후 연구를위한 배아 절단을위한 스트레이트 가위. (G) 미세 집게 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
OFT 밴딩 2. 봉합 그림. (A) 하나 1cm 스레드 봉합로부터 tweezed.
3. 배양 챔버 그림. (A) 수정란을위한 가습 로커 인큐베이터. (B) 줄무늬 및 제어 배아의 문화 비켜 전을위한 가습 실. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. OFT 밴딩 그림. (A) 전체 HH17 병아리 배아는 수축을 묘사, 스케일 바 = 10mm (B) 도식 표현 예 비켜을 유지사이트 (빨간색). (C) 줄무늬 배아는 OFT 밴딩 후 48 시간 군데, 스케일 바 = 0.5 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 속도 측정 초음파 유래. (A) 제어와 (B)의 대표 속도 프로파일은 1 시간 시점에서 얻은 배아를 줄무늬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 기술은 상대적으로 빠르게 수행하기 쉬운, 그러나 특정 키 포인트는 정확한 다운 스트림 결과를 얻을 수 있도록 염두에 보관해야합니다. 배아는 충분한 수분 보충을 제공하는 타이로드의 버퍼를 포함하는 배양 접시에서 비켜 예를 유지되어야한다. 타이로드의 버퍼와 노른자 수술 후 수분을하고 배양 챔버가 적절하게 수화되어 있는지 확인하는 것도 중요하다. 출혈이 볼 수 또는 노른자가 조금이라도 깨진 경우 수술은 배아에서 수행 할 수 없습니다. 특히 장기간의 실험, 배아의 생존에 영향을 미칩니다. 배아 치사의 또 다른 잠재적 인 원인은, 첫째, 따라서 크게 심장 기능을 손상시키지 적용 할 때 OFT 주위에 밴드가 너무 꽉 여부입니다.
현재, 우리는 OFT 밴딩에 혈류 속도의 변화를 결정하는 도구로서 확증 초음파를 사용한다. 미래에, 우리는 (마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 이용하여 확인합니다CT). 우리는 또한 시각적으로 B 모드 2D 이미지에서 OFT 주위의 밴드 압박감을 결정합니다. 중요한 것은, 심장 박동 및 체적 흐름 (CFD를 사용하여 계산)의 차이는 줄무늬와 대조군 17 배아 사이에 관찰되지 않습니다. 이들은 심장 혈관 시스템의 생리 따라서 더 밴딩 개입의 유효성을 검사의 줄무늬 배아에 손상되지 않았 음을 나타냅니다.
목적하는 시점에서, 밴딩 후, 분석은 여러 중요한 밸브 발달 과정에서 혈역학 변경의 효과를 이해하기 위해 수행 될 수있다. 이들은 다음을 포함하지만, ECM 성분들의 위치 파악을 결정하고 OFT의 미세 구조를 결정하고, 밸브의 개발에 관련된 핵심 조절 유전자의 전사 수준의 변화를 결정하고, 이에 제한되지 않는다.
마지막으로,이 기술은 윈도우 (19) 내부 계란 배아에서 OFT 밴딩의 현재 방법을 개선한다. 그 방법은 심각LY 하류 분자 분석을 수행 할 필요가 배아를 축적하는 무능력에 의해 방해. 이 새로운 기술은 물론 구조 실험에 사용될 수있다. OFT 줄무늬가 구조 및 배아가 모욕을 복구하도록 허용하는이 응용 프로그램은 수 있습니다. 전류 메소드는 수행하지 여전히 유의 하류 분석을 수행 할 수있다.
우리는 성공적으로 초기 발달 단계 (- 17 HH 16)에 병아리 태아의 심장에 혈류 역학적 자극을 변경하려면이 기술을 사용하고있다. 발달의 후기 단계에서 수술을 수행 할 때 밴딩 프로토콜 인해 배외 (extraembryonic) 혈관의 어느 새김의 위험에 도전을 제공 할 수 있습니다. 또한, 개발의 후반 단계에서, 계란 내용이 배양 접시에 옮겨 때 그대로 골목 노른자를 유지하는 것이 어렵다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
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