Protocol
Fågelembryon inte anses ryggradsdjur enligt IUCAC regler.
1. Skaffa embryon för kirurgi
- Inkubera 80 - 90 befruktade Bovan hönsägg (trubbiga änden upp) i en fuktad (60%) rocker inkubator vid 40 ° C i ungefär 72 h för erhållande av embryon vid Hamilton och Hamburger (HH) stadium 17. Bestäm exakta antal ägg baserat på effektanalys och överlevnaden av embryon 17. Använd plast äggbrickor för inkubation för att tillåta tillräcklig luftcirkulation.
- När detta önskade utvecklingsstadiet uppnås, häll ca 20 ml varm (37 ° C) Tyrodes buffert (kompletterat med natriumbikarbonat (1 g / L)) i en 100 mm x 26 mm petriskål.
- Sterilisera ett äggskal med 70% etanol.
- Försiktigt knäcka skalet med en skalpell handtag och försiktigt släppa sitt innehåll i skålen som innehåller Tyrodes buffert. Släng embryon om (i) de visuellt verkar onormal (ii) deär inte i rätt utvecklingsstadium (iii) de felaktigt inriktat på gulan och / eller (iv) någon blödning uppstår. Behålla alla embryon som inte utsätts för operation omedelbart efter att ha placerats ex ovo vid 40 ° C för att inte äventyra utvecklingen.
Obs: Staging utförs baserat på Hamilton och Hamburger 18. Abnormitet i kycklingembryon bestäms med blotta ögat och under dissektion omfattning. Se till att embryot har rätt vikning och böjning och kärl.
2. OFT Ränder
- Plockar ut enskilda 1 cm långa trådar från en enda 11/0 nylon kirurgisk sutur och bildar en lös knut. UV sterilisera alla förformade knop.
- Enligt en dissektion mikroskop, visuellt se till att hjärtat slår i normal takt (~ 120 slag / min). Om inte, kasta embryot.
- Precis innan kirurgi, tillämpas 5 - 6 ml varm (37 ° C) Tyrodes buffert till embryot ytan med användning av en pipett.
- Pass en fri ände av den förformade knut under OFT, placera suturen vid OFT / ventrikeln korsning (OVJ) (eller önskad plats), och passera den fria änden i knut därigenom bromsande OFT inklusive membran som omger hjärtat.
- Efter operationen, väta ytan av äggulan med 5 - 6 ml varm (37 ° C) Tyrodes buffert med användning av en överföringspipett.
- Bibehålla embryon kontroll ex ovo som de bandade embryon; dock inte utsätta dem för det kirurgiska ingreppet.
- Inkubera embryona, för den önskade mängden tid, vid 40 ° C i en fuktad (60%) inkubator.
- När önskad tidpunkt har nåtts, skära embryot från äggulan med hjälp av raka sax. Dissekera hjärta med fin pincett och använda flera nedströms studier såsom förändringar i hjärt morfologi på grund av förändrad hemodynamik 17.
3. Bekräfta att Banding Intervention orsakar en förändring i Hemodynamik
Obs: Den partiella sammandragning orsakad av bandnings ingripande leder till en ökning av blodflödeshastigheten vid OVJ. Denna hemodynamiska parametern är bekvämt bedömas med 2D-ultraljudsundersökningar, som genomförs vid den önskade tidpunkten för experimentet.
- Eftersom endast en enda embryo kan avbildas på en gång, upprätthålla alla andra embryon avsedda för ultraljudavbildning i en 40 ° C inkubator.
- Placera petriskålen innehållande embryot som skall avbildas på en värmedyna inställd på 40 ° C.
- Fyll skålen, upp till brädden, med varmt (37 ° C) Tyrodes buffert. Häll långsamt buffertlösningen in i skålen för att hålla äggulan intakt. Om emellertid är integriteten hos gulan äventyras under detta steg, kassera embryot.
- Orient embryot så att den centrala axeln av embryot är vinkelrät mot ultraljudssonden som är upphängd i ett justerbart ställ.
- Med ultraljud maskin operating i B-mode, erhålla en 2D-bild av pulserande hjärta på skärmen och flytta scenen (värmedynan) så att OFT, ventrikeln och OVJ syns tydligt.
- Växla till den pulsade vågen (PW) läge, vid den önskade pulsrepetitionsfrekvens (t.ex. 20 kHz) och erhålla hastighetsdata exakt på OVJ. En B-mode bilden av pulserande hjärta erhålls på skärmen.
- Flytta scenen för att se OFT, ventrikeln och OVJ. Använder ultraljudsmaskinen programvara, få hastighetsmätningar exakt vid OVJ.
Obs: Om pulsen av ett embryo minskar under avbildning, bör sålunda erhållna hastighetsdata inte användas för analys. Alla embryon som används för hastighetsmätning skall helst inte användas för något annat experiment efter ultraljudsundersökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visas i figur 1 rekommenderas instrument som behövs för OFT bandning. Petriskålen (Figur 1A) som innehåller embryot ex ovo bör vara tillräckligt djupt för att inte förstöra embryot när den är täckt med locket. Djupa petriskålar (Figur 1C) bör också användas för ultraljudsundersökningar för att möjliggöra en tillräcklig volym Tyrodes buffert för att hällas ovanpå äggulan.
En enda 1 cm tråd (Figur 2A) är tweezed ut från en 11/0 nylonsutur (Figur 1A) och bundna till en lös knut (Figur 1B). Alla förformade knop är UV-steriliseras. Figur 3A visar en befuktad rocker kammare där befruktade hönsägg inkuberas tills den önskade scenen. Figur 3B visar ett embryo inkubator, där banded och embryon kontroll bibehålls ex ovo
Visas i figur 4A är en HH17 embryo ovanpå äggulan ex ovo. Figur 4B är en schematisk representation som visar positionen av suturen (band) vid OVJ av en HH17 embryo. Figur 4C är en representativ bild av en bandad embryo avbildas 48 h efter kirurgi.
Effekten av bandnings intervention på blodflödeshastighet genom förträngningen stället mäts genom 2D ultraljudsavbildning. Som väntat, är hastigheten vid OVJ högre i den bandade embryot i förhållande till kontrollen (Figur 5). Vi har nyligen utfört Computational Fluid Dynamics (CFD) analys av bandade och kontroll hjärtan vid 24 h tidpunkt som visar effekterna av OFT bandning på blodflödeshastigheten och vägg skjuvspänning 17.
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figur 1. kirurgiska instrument. (A) 11/0 nylon sutur. (B) Petri platta innehållande förformade knop. (C) Djuppetriskål för ex ovo embryo kultur och ultraljud. (D) överföringspipett. (E) skalpell handtag att knäcka äggskalet. (F) Raka sax för embryo excision för post-kirurgiska studier. (G) fin pincett klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Suture för OFT Banding. (A) En enda 1 cm tråd tweezed ut från en sutur.
Figur 3. Inkubation Chambers. (A) Befuktad rocker inkubator för befruktade ägg. (B) fuktig kammare för ex ovo kultur av bandade och kontrollembryon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. OFT Banding. (A) Hela HH17 kycklingembryo underhålls ex ovo, skala bar = 10 mm (B) Schematisk visar förträngningenplats (röd). (C) Banded embryo avbildas 48 timmar efter OFT banding, skala bar = 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Ultraljud-derived hastighetsmätningar. Representativa hastighetsprofiler (A) kontroll och (B) bandad embryon erhålls vid en 1 timme tidpunkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna teknik är relativt snabb och enkel att utföra, men vissa viktiga punkter måste hållas i minnet, så att få korrekta resultat nedströms. Embryon bör bibehållas ex ovo i en petriskål som innehåller Tyrodes buffert för att ge adekvat rehydrering. Det är också viktigt att hydratisera gulan post-kirurgi med Tyrodes buffert och för att se till inkubationskammaren är tillräckligt hydrerad. Operationer bör inte utföras på ett embryo om någon blödning är synlig eller äggula är ännu något bruten. Detta påverkar embryo överlevnad, särskilt för långtidsförsök. En annan potentiell orsak till dödlighet embryon är om bandet runt OFT är alltför snäv när det appliceras först, alltså betydligt äventyra hjärtfunktionen.
För närvarande använder vi ultraljud som ett bekräftande verktyg för att bestämma förändringen i blodflödet hastighet på OFT bandning. I framtiden kommer vi att bekräfta med mikro-datortomografi (CT). Vi har också visuellt bestämma bandet täthet runt OFT i B-mode 2D-bilder. Viktigare, är inga skillnader i hjärtfrekvens och volymetriskt flöde (som beräknats med hjälp av CFD) observeras mellan embryon i den bandade och kontrollgrupper 17. Dessa indikerar att fysiologi det kardiovaskulära systemet inte äventyras i den bandade embryon, vilket ytterligare validerar bandnings ingripande.
Vid den önskade tidpunkten, efter banding flera analyser kan utföras för att förstå effekten av förändrade hemodynamik på kritiska ventil utvecklingsprocesser. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, bestämma förändringar i transkriptnivåer av viktiga reglerande gener som är involverade i ventil utveckling, bestämma lokalisering av ECM-komponenter och bestämma ultra av OFT.
Slutligen förbättrar denna teknik på den nuvarande metoden för ränder OFT i embryot inuti fönster ägg 19. Denna metod är svårly hindras av oförmågan att ackumulera nödvändiga embryon att göra nedströms molekylära analyser. Denna nya teknik kan användas i räddningsexperiment samt. Denna applikation gör det möjligt för den bandade OFT räddas och embryot får återhämta sig från den förolämpning. Ingen nuvarande metoden kan göra detta och ändå kunna utföra statistiskt signifikanta analyser nedströms.
Vi har framgångsrikt använts denna teknik för att ändra de hemodynamiska stimuli i hjärtat av kycklingembryon i ett mycket tidigt utvecklingsstadium (TT 16-17). Bandnings protokollet kan utgöra en utmaning när du utför operationen vid senare stadier av utveckling på grund av risken för nicking någon av de extraembryonic blodkärl. Också i sena stadier av utveckling, är det ofta svårt att hålla gulesäcken intakt när äggets innehåll överförs till petriskål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S.
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
