Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تطوير وتوصيف Published: May 19, 2016 doi: 10.3791/54014
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University
* These authors contributed equally

Abstract

تتعرض الخلايا البطانية (ECS) المبطنة لجدران الأوعية الدموية في الجسم الحي باستمرار في التدفق، ولكن غالبا ما تزرع ECS مثقف في ظل ظروف ثابتة ويحمل النمط الظاهري الموالية للالتهابات. على الرغم من أن تطوير أجهزة ميكروفلويديك وقد تبنت من قبل المهندسين أكثر من عقدين، لا تزال تطبيقاتها البيولوجية محدودة. (أ) في المختبر نموذج microvessel أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية التصديق عليها من قبل التطبيقات البيولوجية مهم للمضي قدما في الميدان، وردم الفجوات بين في الجسم الحي والدراسات في المختبر. هنا، نقدم الإجراءات التفصيلية لتطوير شبكة microvessel مثقف باستخدام جهاز ميكروفلويديك مع قدرة نضح على المدى الطويل. علينا أن نبرهن أيضا تطبيقاتها لقياس الكمية من التغيرات التي يسببها ناهض في المفوضية الأوروبية ط وأكسيد النيتريك (NO) إنتاج [2+ كا] في الوقت الحقيقي باستخدام متحد البؤر والفحص المجهري مضان التقليدية. الشبكة microvessel شكلتوأظهر العمل مع نضح المستمر تقاطعات متطورة بين ECS. VE كادهيرين التوزيع كان أقرب إلى تلك التي لوحظت في microvessels سليمة من الطبقات الوحيدة EC مثقف بشكل ثابت. ATP الناجم عن الزيادات العابرة في المفوضية الأوروبية [كا 2+] تم قياس ط وأي إنتاج الكمية في مستويات الخلايا الفردية، والذي صادق على وظيفة من microvessels مثقف. هذا الجهاز ميكروفلويديك يسمح ECS على النمو في ظل ذلك، تدفق ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي تسيطر عليها بشكل جيد، مما يجعل بيئة زراعة الخلايا أقرب إلى المجراة من ذلك في والثقافات 2D الثابتة التقليدية. تصميم شبكة متناهية أنها تتمتع بتنوع كبير، وعملية التصنيع بسيطة وقابلة للتكرار. الجهاز يمكن دمجها بسهولة إلى النظام المجهري متحد البؤر أو التقليدية تمكين ارتفاع القرار التصوير. الأهم من ذلك، لأن الشبكة microvessel مثقف يمكن تشكيلها من قبل ECS الإنسان الأساسية، وهذا النهج بمثابة أداة مفيدة لمعرفة كيفمرضي مكونات الدم غيرت من عينات المرضى تؤثر ECS الإنسان وتوفر نظرة ثاقبة القضايا السريرية. كما يمكن وضعها كمنصة لفحص المخدرات.

Introduction

تتعرض الخلايا البطانية (ECS) المبطنة لجدران الأوعية الدموية في الجسم الحي باستمرار في التدفق، ولكن غالبا ما تزرع ECS مثقف في ظل ظروف ثابتة ويحمل النمط الظاهري الموالية للالتهابات 1،2. التكنولوجيا على microfluidics تمكن السائل تسيطر على وجه التحديد من خلال مقيدة هندسيا الميكروسكيل (جنوب ملم) قنوات 3، والذي يوفر فرصة للخلايا المستزرعة، وخاصة بالنسبة الأوعية الدموية ECS، لتنمو في ظل ظروف التدفق المطلوب. هذه الميزات تجعل من شروط الثقافة خلية أقرب إلى المجراة من، ثابتة مزارع الخلايا 2D التقليدية. أنها مهمة للغاية عند استخدام الأجهزة ميكروفلويديك لنموذج أنواع مختلفة من vasculatures ودراسة ردود المفوضية الأوروبية إلى التحفيز الميكانيكية و / أو الكيميائية.

على الرغم من المزايا التي أظهرتها شبكة متناهية على ثقافة خلية ثابتة، وتكييف وتطبيق على microfluidics في و الطبيةدرع لا تزال محدودة. رواه استعراض أجري مؤخرا، فإن الغالبية من منشورات هذا المجال (85٪) لا تزال في المجلات الهندسية 4. لم يكن أداء الأجهزة ميكروفلويديك إقناع بما فيه الكفاية بالنسبة لمعظم علماء الأحياء إلى التحول من التقنيات الحالية مثل فحص Transwell والمستوى الكلي للانزلاق طبق ثقافة / الزجاج لهذا الجهاز المنمنمة. على microfluidics هو حقل متعدد التخصصات، الأمر الذي يتطلب التعاون بين التخصصات لنقل هذا الحقل إلى الأمام. والهدف من هذه المادة هو تقنية للحد من الفجوات المعرفية بين التخصصات وجعل الإجراءات تلفيق مفهومة من قبل علماء الأحياء، في الوقت الذي توفر تطبيق البيولوجي والتحقق من صحة وظيفية من microvessels الموائع الدقيقة. تتضمن البروتوكولات التجريبية تصور تصنيع كلا الجهازين ميكروفلويديك ومرافقها الحيوية، وهو ما يمثل التعاون الوثيق بين المهندسين وعلماء الأحياء.

بلغنا مؤخرا بعضالتطبيقات البيولوجية باستخدام المختبر في شبكة microvessel مع جهاز ميكروفلويديك 5. من أجل تصميم ملائم أبعاد الشبكة متناهية وتطبيق إجهاد القص المطلوب، تم بناء نموذج عددي مع الحسابية البرنامج الحيوي السائل لتقدير عن كثب الشخصي التدفق. الوريد السري الخلايا الأولية البشرية البطانية (HUVECs) التي تم المصنف إلى و microchannels صلت التقاء، أي تغطي الأسطح الداخلية بأكملها متناهية، في 3-4 أيام مع نضح المستمر. وقد تجلى تشكيل حاجز السليم عن طريق تلطيخ VE كادهيرين ومقارنة مع تلك التي تكونت في ظل ظروف زراعة الخلايا الثابتة وفي microvessels سليمة. من خلال تطبيق البروتوكولات التجريبية المتقدمة في microvessels سليمة perfused بشكل فردي 6-8، قمنا بقياس كمي التغييرات في المفوضية الأوروبية [كا 2+] انا واكسيد النيتريك (NO) الإنتاج استجابة لأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) مع الفلورسنت فيdicators ومتحد والفحص المجهري مضان التقليدية. [كا 2+] تم الإبلاغ عن الزيادات الناجمة عن ناهض في المفوضية الأوروبية ط وأي إنتاج كإشارات الخلايا اللازمة لزيادة التهابات الناجمة عن الوسيط في microvessel نفاذية 6-15. على الرغم من أن بعض الدراسات السابقة أظهرت لقطات من أجهزة ميكروفلويديك DAF-2 DA تحميل 16،17، وكان قرار والبيانات المناسبة التحليل لم تحقق بعد 18 عاما. على حد علمنا، توضح هذه الدراسة القياسات الكمية الأولى من التغيير الديناميكي الناجم عن ناهض في البطانية [كا 2+] انا وأي إنتاج الاستفادة ميكروفلويديك النظام القائم.

تقنيات التصنيع الدقيق لديها المرونة لافتعال microchannels وصولا الى بضعة ميكرونات وتمكن من تطوير أنماط معقدة لتقليد هندستها من الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي. نحن هنا قدم شبكة متناهية نموذجية مع ثلاثة مستويات من المتفرعة. هذاملفقة الشبكة عن طريق الجمع بين ضوئيه التي تتم في غرف الأبحاث التصنيع الدقيق والطباعة الحجرية الناعمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصنيع جهاز ميكروفلويديك

  1. تلفيق الطباعة التصويرية القياسية من SU-8 العفن 50 ماستر
    1. تنظيف رقاقة السيليكون قبل تدور طلاء. شطف عارية 2 بوصة رقاقة السيليكون مع الأسيتون لمدة 15 دقيقة تليها الإيزوبروبيل (IPA) لمدة 15 دقيقة. يذوى الرقاقة عن طريق وضعه على موقد في 150 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بعد الجفاف، تبريد رقاقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. تدور معطف رقاقة السيليكون مع SU-8 مقاومة للضوء. إضافة 2 مل SU-8 مقاومة للضوء على الرقاقة. المنحدر الرقاقة إلى 500 دورة في الدقيقة في 100 دورة في الدقيقة التسارع / ثانية لمدة 10 ثانية، تليها 1000 دورة في الدقيقة في 300 دورة في الدقيقة التسارع / ثانية لمدة 30 ثانية. (انظر التكميلي فيديو 1)
    3. قبل خبز الرقاقة على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم تخبز لينة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. استخدام التعرض للأشعة فوق البنفسجية لتحويل نمط تصميم من قناع الفيلم لمقاومة للضوء المغلفة زيادة ونقصان. طباعة على نمط فيلم شفافة رقيقة كقناع الفيلم. وضع قناع الفيلم على قمةتدور المغلفة مقاومة للضوء وفضح للأشعة فوق البنفسجية مع جرعة من 300 ميغا جول / سم 2. (انظر التكميلي فيديو 2)
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، ونمط شبكة متناهية (159 ميكرون قنوات الأم واسعة المتفرعة إلى أربع 100 ميكرون قنوات ابنة واسعة) صمم مع برنامج CAD. نمط على الفيلم يظهر كحقل واضح ويتم تغطية بقية الفيلم من الحبر الأسود. لأن SU-8 هو مقاومة للضوء سلبي، وجزء من مقاومة للضوء أن يتعرض للأشعة فوق البنفسجية يكون crosslinked وتصبح غير قابلة للذوبان في المذيبات خلال تطوير قالب (الخطوة 1.1.6). بعد التطور، وهذا جزء غير قابل للذوبان تكرار نمط شبكة مصممة، ويكون بمثابة القالب الرئيسي.
    5. بعد خبز الرقاقة تعرض على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، ثم 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    6. تطوير القالب الرئيسي. استخدام SU-8 مطور مثل المذيبات لإزالة مقاومة للضوء، crosslinked الامم المتحدة. تزج الرقاقة في SU-8 المطور لمدة 3 دقائق واشطفيه IPAلمدة 1 دقيقة.
    7. كرر هذه دورة تطوير 2-3 مرات حتى يكون هناك تشكيل خط أبيض (بقايا من مقاومة للضوء عدم الشفاء) بعد شطف IPA. يجف بلطف رقاقة مع غاز النيتروجين ودراسة ملامح صغيرة من نمط تحت المجهر. تكرار دورات تطوير إضافية إذا لزم الأمر.
    8. من الصعب خبز الرقاقة على طبق ساخن على 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. الطباعة الحجرية الناعمة
    1. مزيج يدويا شطري (قاعدة وكيل علاج) من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) المطاط الصناعي في وزن. نسبة 10: 1.
    2. دي من الغاز الطبيعي في خليط PDMS مع مجفف اتصال مع فراغ المنزل لمدة 15 دقيقة. يلقي حل PDMS على القالب مقاومة للضوء الرئيسي. يحتاج سمك PDMS أن يكون أكثر من 3 ملم لتوفير عقد مستقر للأنابيب مدخل / مخرج. دي الغاز PDMS مرة أخرى لمدة 15 دقيقة، وإزالة فقاعات الهواء المتبقية مع غاز النيتروجين إذا لزم الأمر. علاج PDMS مسبوكة في الفرن على 65 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    3. تنظيف سطحساترة الزجاج مع الاسكتلندي ونظافة البلازما (30 ثانية العلاج البلازما). تدور معطف PDMS الشفاء الامم المتحدة (0.5 مل) على ساترة الزجاج من خلال زيادة إلى 4000 دورة في الدقيقة في 500 دورة في الدقيقة معدل تسارع / ثانية لمدة 30 ثانية. علاج ساترة PDMS المغلفة تدور في الفرن على 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    4. قطع والافراج عن PDMS شفي من القالب الرئيسي. قم بإنشاء مدخل ومخرج مع 1 مم الناخس حفرة قطرها في نهاية البعيدة للقنوات الأم.
    5. السندات الجهاز إلى ساترة الزجاج المطلي تدور PDMS. أكسدة أسطح PDMS وساترة مع نظافة البلازما لمدة 1 دقيقة. بعد العلاج البلازما الأكسجين، ووضع قطرات من الماء منزوع الأيونات (DI الماء) على سطح الترابط، ووضع الأجزاء معا. خبز الجهاز في فرن عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتحقيق الترابط الدائم.

تكميلية الفيديو 1 تكميلية الفيديو 1 (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

تكميلية فيديو 2
تكميلية فيديو 2 (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

2. البطانية البذر الخلية والثقافة

  1. تعقيم الجهاز وفيبرونكتين] طلاء
    1. الحفاظ على الملكية مسعور من سطح PDMS حول مدخل / مخرج من الأكسدة. تغطية سطح PDMS حول مدخل ومخرج مع المشارب صغيرة من الشريط سكوتش لمنع التأكسد. هذا الإجراء يمكن أن يمنع الماء DI من الانتشار في جميع أنحاء السطح العلوي من الجهاز أثناء الخطوة ملء (2.1.3).
    2. علاج الجهاز PDMS مع البلازما الأكسجين FOص 5 دقائق لتغيير السطح ليكون ماء، وبالتالي تسهيل تدفق السوائل من خلال متناهية ومنع فقاعة محاصرة في إجراء ملء (2.1.3).
    3. استخدام أي حقنة بإبرة المرفقة أو ماصة لملء الجهاز بالماء DI من المدخل. مواصلة التعبئة حتى لا يكون هناك قطرات من الماء DI (30-50 ميكرولتر) المتراكمة عند مخرج. فحص الجهاز تحت المجهر لمعرفة ما اذا كان هناك فقاعات محاصرين داخل متناهية. إزالة قطرات الماء المفرطة في مدخل ومخرج مع المناديل الورقية.
    4. تعقيم الجهاز في طبق بتري مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة لا تقل عن 3 ساعات في غطاء الصفحي السلامة الأحيائية. لمنع التبخر، وتغطي مدخل / مخرج مع قطعة رقيقة من PDMS، ووضع المناديل الورقية المبللة داخل الطبق، والتفاف الطبق مع بارافيلم.
    5. معطف الجهاز مع فبرونيكتين. شطف الجهاز لأول مرة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ثم معطف مع 100 ميكروغرام / مل فبرونيكتين بين عشية وضحاها في الثلاجة (4 ° C). وضع قطرة من حل على مدخل، ثم خلق ضغط سلبي عند مخرج مع فراغ المنزل، حقنة بإبرة أو ماصة.
    6. شغل الجهاز مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية. شطف الجهاز مع برنامج تلفزيوني يدويا لمدة 3 مرات قبل تحميل وسائل الإعلام ثقافة الخلية. الاحماء الجهاز في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  2. ECS البذر والغرس والإرواء على المدى الطويل
    ملاحظة: مقارنة مع الثقافة التقليدية ثابتة 2D EC، أدلى في المختبر نموذج شبكة microvessel مع نضح المستمر للبيئة زراعة الخلايا أقرب إلى الأوضاع في الجسم الحي. يمكن الحفاظ في المختبر شبكة microvessel موضح في هذا البروتوكول تصل إلى أسبوعين. ونضح تسيطر عليها بشكل جيد تجديد مستمر المغذية، وإزالة النفايات، ومنع الإفراط في التقاء أحادي الطبقة EC. ولذلك، فإنه يمكن أن تمتد إلى دراسات على المدى الطويل، ومحاكاة البيئة الخلوية والدورة الدموية تحت الفيزيولوجي مختلفةلتر والحالات المرضية.
    1. مزيج HUVECs الأساسي في وسائل الإعلام ثقافة HUVEC (MCDB 131) مع 8٪ ديكستران (مول وزن 70000). يتم استخدام ديكستران لزيادة اللزوجة وسائل الإعلام التحميل وتحقيق أفضل نتيجة خلية البذر. كثافة الخلية الموصى بها هي حوالي 2-4 × 10 6 خلية / مل.
    2. البذور الخلايا في الجهاز. وضع قطرة 10-20 ميكرولتر من الخلايا على مدخل. إدخال تدفق لطيف إما عن طريق إمالة الجهاز، أو عمل شعري باستخدام ماصة باستير الزجاج عند مخرج. المفتاح لتحميل خلية الناجح هو السيطرة على سرعة تدفق أقل من 1 ملم / ثانية ضمن أصغر القنوات.
    3. تحقق من بذر الخلية. بعد البذر الأولي، واحتضان الجهاز لمدة 15-20 دقيقة (جو ترطيب من 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية) قبل التحقق من حالة البذر تحت المجهر. إذا لزم الأمر، نفذ تحميل خلية إضافية لتحقيق كثافة الخلايا المطلوبة.
    4. شطف بلطف الجهاز مع خلية ثقافة المتوسط ​​(37° C) لإزالة ديكستران. ثقافة الجهاز في حالة عدم وجود تدفق لأول ساعة 6 في حاضنة (5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية).
    5. إعداد اتصال أنابيب لنضح على المدى الطويل. الشريط الجهاز في طبق بتري لمنع الحركة. خلق ثقوب صغيرة على غطاء طبق بيتري لمدخل ومخرج أنابيب الإدراج. ربط أنابيب مدخل إلى حقنة بإبرة لوسائل الإعلام نضح ثقافة الخلية. ربط الأنابيب منفذ لجمع النفايات.
      ملاحظة: ضع الجهاز وجمع النفايات في حاضنة الثقافة الخلية، في حين وضع مضخة نضح خارج الحاضنة وتوصيله مع الجهاز عن طريق أنابيب مدخل طويل. يتم تحديد معدل نضح من التصميم التجريبي. في الجهاز الحالي، استخدام معدل نضح من 0.35 ميكرولتر / دقيقة ومجموعة إجهاد القص بين 1-2 داين / سم 2. تحت هذا الشرط التروية، وHUVECs تصل إلى نقطة التقاء في حوالي 3-4 أيام.

3. أناmmunofluorescent تلطيخ

  1. إصلاح ECS في الجهاز عن طريق نضح من 2٪ امتصاص العرق لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية، تليها برنامج تلفزيوني 1X الشطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، و 1٪ BSA عرقلة لمدة 30 دقيقة. استخدام معدل نضح هذا هو نفسه الذي استعمل للثقافة الخلية.
  2. Permeabilize وECS ثابتة لتلوين الأجسام المضادة مع 0.1٪ تريتون X-100. يروي الجهاز مع تريتون لمدة 5-7 دقيقة إلى تسمية VE كادهيرين، و 3 دقائق لتسمية F-الأكتين.
  3. تحميل الأجسام المضادة في الجهاز. يروي الجهاز مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة لتغسل الحلول السابقة. يدويا تحميل الأجسام المضادة الأولية ضد VE كادهيرين (مكافحة الماعز) في الجهاز على تركيز من 2 ميكروغرام / مل (الحجم الكلي هو 20-50 ميكرولتر). إبقاء الجهاز في الثلاجة على 4 درجات مئوية خلال الليل. يروي الأجسام المضادة الثانوية (حمار المضادة للماعز) من قبل ضخ حقنة في تركيز 7 ميكروغرام / مل لمدة 45-60 دقيقة.
  4. تسمية EC F-الأكتين مع phalloidin. يروي الجهاز مع FO برنامج تلفزيوني 1Xص 15 دقيقة قبل تحميل phalloidin (10 ميكروغرام / مل) يدويا لمدة 7-10 دقائق.
  5. التسمية نوى EC (انظر قائمة المواد).
  6. شطف الجهاز مع برنامج تلفزيوني 1X، والحفاظ عليه في 4 درجات مئوية حتى التصوير.

4. الإسفار التصوير من غشائي [كا 2+] ط

  1. يروي الجهاز مع الزلال (10 ملغ / مل) حل -Ringer لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استخدام نفس معدل نضح كما أن استخدامها للثقافة الخلية. ووصف تركيزات جميع مكونات حل الألبومين قارع الأجراس في قائمة المواد.
  2. اقامة نظام متحد البؤر لEC [كا 2+] ط التصوير مع فلوو-04:00. استخدام نظام المجهري متحد البؤر التصوير كاليفورنيا 2+. استخدام ليزر الأرجون (488 نانومتر) لالإثارة وتعيين الفرقة الانبعاثات كما 510-530 نانومتر. جمع الصور مع الهدف 25X (الغمر بالماء، NA: 0.95) في 512 × 512 شكل المسح الضوئي. استخدام خطوة ض 2 ميكرون وفاصل لمسح كل كومة من أناالسحراء من 20 ثانية.
  3. يروي الجهاز مع فلوو-04:00 (5 ميكرومتر) لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم تغسل التجويف فلوو-04:00 مع حل الألبومين رينغر.
  4. الحصول على صور من microvessels فلوو-4 تحميل. جمع الصور الأساس لمدة 10 دقيقة. يروي الجهاز مع ATP (10 ميكرون) وتسجيل التغيرات في كثافة مضان (FI) لمدة 20 دقيقة.

5. الإسفار التصوير من اكسيد النيتريك الإنتاج

  1. يروي الجهاز مع حل الألبومين رينغر لمدة 15 دقيقة. استخدام معدل نضح هذا هو نفسه الذي استعمل للثقافة الخلية.
  2. إعداد نظام التصوير مضان لقياس يسببها ATP إنتاج أكسيد النتريك. استخدام المجهر مزودة كاميرا CCD الرقمية 12-بت ومصراع الكمبيوتر التي تسيطر عليها لقياس أكسيد النيتريك. استخدام مصباح زينون 75 واط كمصدر للضوء.
    ملاحظة: حدد الإثارة وانبعاث الطول الموجي للDAF-2 DA من قبل مرشح تدخل (480/40 نانومتر) ومرآة مزدوج اللون(505 نانومتر) مع وجود حاجز الفرقة تمرير (535/50 نانومتر). استخدام عدسة الهدف 20X (NA: 0.75) لجمع الصور. لتقليل photobleaching من، وضع مرشح الكثافة المحايدة (0.5 N) أمام مرشح التدخل والحد من وقت التعرض إلى 0.12 ثانية.
  3. تحميل الخلايا مع DAF-2 DA (5 ميكرومتر). يروي الجهاز مع DAF-2 DA لمدة 35-40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تسجيل الأساس DAF-2 مضان شدة (FI DAF) بعد التحميل الأولي.
    ملاحظة: DAF-2 DA موجودا باستمرار في الإرواء في كافة مراحل التجربة 7.
  4. جمع DAF-2 الصور. تسجيل الأساس FI DAF لمدة 5 دقائق. يروي الجهاز مع ATP (10 ميكرون) وجمع الصور لمدة 30 دقيقة مع 1 فترات دقيقة. جمع كل الصور من نفس مجموعة من الخلايا في الطائرة الاتصال نفسه.

تحليل 6. البيانات

  1. يدويا تحديد المنطقة المصالح (رويس) من الصور التي تم جمعها على مستوى الخلايا الفردية. كلالعائد على الاستثمار يغطي مساحة خلية فردية واحدة والتي يمكن أن يتضح من المخطط مضان.
  2. طرح مضان الخلفية وحساب FI يعني كل رويس.
  3. قياس التغيرات التي يسببها اعبي التنس المحترفين في المفوضية الأوروبية [كا 2+] انا وأي إنتاج. حجم التغيرات التي يسببها اعبي التنس المحترفين في المفوضية الأوروبية [كا 2+] ط عن طريق حساب التغيرات في فلوو-4 FI (FI / FI 0 * 100، حيث FI 0 هو متوسط ​​FI الأساسي خلال الألبومين قارع الأجراس نضح قبل إضافة ATP) ناقص قياس خلفية. تحديد NO معدل الإنتاج من خلال إجراء أول تحويل التفاضلية للFI DAF مع مرور الوقت.
    ملاحظة: بالطبع وقت FI DAF يمثل إنتاج NO التراكمي مع مرور الوقت. لذلك، يتم احتساب NO معدل الإنتاج استنادا إلى بيان من FI DAF تحت كلا القاعدية وحفز ATP الظروف. وقد وصفت تفاصيل تحليل البيانات والإجراءات التجريبية في منشور السابق 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يعرض هذا القسم بعض النتائج التي تم الحصول عليها مع شبكة microvessel مثقف وضعت لهذا البروتوكول. نمط متناهية هو عبارة عن شبكة المتفرعة ثلاثة مستويات (الشكل 1A). في هذا التصميم، وهو 159 ميكرون واسعة فروع قناة الام الى قسمين 126 ميكرون قنوات واسعة، وفروع أخرى إلى أربع 100 ميكرون قنوات ابنة واسعة. تم إجراء المحاكاة العددية 3D لتقدير توزيعات إجهاد القص تحت معدل تدفق 0.35 ميكرولتر / دقيقة (الشكل 1B)، مما يدل على ثلاثة مستويات مختلفة من إجهاد القص داخل هذه الشبكة متناهية. ومن المتوقع تدفق الصفحي داخل و microchannels أن تكون مستقرة hydrodynamically دون وجود تدفق بالانزعاج أو الثانوي. بعد أن تم ملفقة القالب الرئيسي SU-8 مع عملية ضوئيه القياسية (الشكل 1C)، كانت ملفقة جهاز PDMS من خلال الطباعة الحجرية الناعمة لتكرار شمال شرق متناهيةتصميم twork الى شفافة والهواء سقالة نفاذية (1D الشكل - E). بعد EC البذر (الشكل 1F - G) و3-4 أيام التروية المستمر، وصلت ECS التقاء وغطت بنجاح الأسطح الداخلية للو microchannels.

EC F-الأكتين ونوى وfluorescently المسمى داخل الشبكة ويتضح مع الصور مبائر. تحت إجهاد القص من 1.0 داين / سم 2، حوالي 30٪ من HUVECs ممدود على طول اتجاه تدفق مع زيادة الألياف الإجهاد المركزية، في حين أن بقية 70٪ حافظت على نمط حصاة كبيرة مع يهيمن عليها الطرفية F-الأكتين 5. ويبدو أن تغيير شكل الخلية التي يسببها القص أقل أهمية من تلك التي لوحظت عادة في 2D الثقافات خلية ثابتة. في الواقع في ظل ظروف في الجسم الحي، وECS لها أشكال مختلفة من الخلايا في أنواع مختلفة من السفن، ولكن ليس من السهل تغيير شكل الخلية ردا على تشا تدفق nges. وهناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد ما إذا كان هذا الاختلاف نتائج هندسة قناة والبيئة نضح التي هي أقرب إلى الأوضاع في الجسم الحي.

نحن أيضا قياس بنجاح التغييرات التي يسببها اعبي التنس المحترفين في المفوضية الأوروبية [كا 2+] انا وأي إنتاج (الأرقام 4 و 5). ATP الناجم عن الزيادات العابرة في المفوضية الأوروبية [كا 2+] انا وأي إنتاج. وكان متوسط ​​ذروة FI فلوو-4 187 ± 22٪ من خط الأساس، التي وقعت في 35 ± 10 ثانية بعد بدء ATP الارواء. وقد ارتفع معدل أي إنتاج من مستوى القاعدية من 0.15 ± 0.05 الاتحاد الافريقي في دقيقة إلى 1.18 ± 0.37 AU لكل دقيقة خلال أول خمس دقائق من التعرض للاعبي التنس المحترفين. تم الإبلاغ عن جميع النتائج على النحو الخطأ المعياري يعني ± (جنوب شرق). تكون قابلة للمقارنة لنتائج مستمدة من الأوردة سليمة perfused بشكل فردي 6،9،14،19.

ف together.within الصفحات = "1"> الشكل 1
الشكل 1: تصنيع جهاز ميكروفلويديك وEC تحميل (A) وتخطيطيا للشبكة متناهية. يشار إلى زاوية عرض وتشعب و microchannels في كل المستويات المتفرعة. (ب) المحاكاة العددية للتوزيع إجهاد القص. معدل التدفق هو 0.35 ميكرولتر / دقيقة. ارتفاع متناهية بعد تطوير 80 ميكرون. تم تعديل هذه الأرقام اثنين من القراءات السابقة مع تفاصيل إضافية 5. (ج) وضع القالب الرئيسي. ملفقة القالب الرئيسي للشبكة متناهية مع SU-8 مقاوم الضوء على رقاقة السيليكون. (د) عملية الطباعة الحجرية الناعمة. ومحمل PDMS الخليط على القالب الرئيسي والشفاء في الفرن. (E) الربط PDMS قناة إلى الركيزة. الركيزة المستخدمة في هذا الجهاز هو الصبان ساترةالمغلفة ن بطبقة رقيقة من PDMS. يتم إنشاء مدخل ومخرج مع وجود ثقب الناخس. (F و G) EC التحميل. يتم وضع حوالي 10 ميكرولتر من محلول خلية في المدخل. ثم هو فعل وتدفق لطيف من خلال وضع ماصة باستور عند مخرج عبر تدفق شعري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: صور متحد البؤر EC F-الأكتين في شبكة متناهية مثقف (A) وتخطيطيا للتصميم الشبكات. يشار إلى D في الرسم البياني - في مناطق مختارة هو مبين في (ب). (B - D) صور متحد البؤر EC F-الأكتين (أحمر) ونوى (الأزرق) من في المختبر شبكة microvessel ب 1. C 1 و D 1 هي الصور المعروضة من النصف العلوي من مداخن صورة متناهية، وب 2، ج 2، ودال 2 والتوقعات صورة من النصف السفلي من مداخن صورة. E. أشارت عرض مستعرضة كما 1-1، 2-2، و3-3 "في ب 1 - D 1، شريط مقياس = 100 ميكرون. تتكيف هذه الصور من المنشور السابق 5. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): مقارنات VE كادهيرين التوزيع في شبكة microvessel مثقف مع أحادي الطبقة EC مثقف بشكل ثابت وسليم الوريد المساريقي الفئران (. B - D. (B - D) VE كادهيرين (الخضراء) ونواة الخلية (الأزرق) تلطيخ في المختبر microvessel شبكة D 1 و D 2 هي الجزء العلوي والسفلي من الصور المعروضة التي تم جمعها من المنطقة التشعب نفسها، على التوالي. (E) VE كادهيرين تلطيخ للمثقف بشكل ثابت ECS. (F) VE كادهيرين تلطيخ perfused بشكل فردي الوريد الفئران سليما. هذا الرقم تنطبق 5. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: ATP الناجم عن الزيادات في المفوضية الأوروبية [كا 2+ ص>] ط. وقد أجريت التجارب من 4 أجهزة و7-12 رويس (فرد ECS) لكل جهاز اختيرت لتحليل البيانات. (A) وبطبيعة الحال وقت ATP (10 ميكرون) -induced التغييرات في المفوضية الأوروبية [كا 2+] ط (فلوو 4 FI / FI 0 × 100٪ ± SE) من تجربة تمثيلية واحدة. (ب) وصور للتجربة تمثيلية (يتم عرض البيانات في A). هذا هو الرقم المنشور سابقا 5. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: ATP-يسببها أي إنتاج أجريت التجارب في 3 أجهزة واختير 11-12 رويس (فرد ECS) لكل جهاز لتحليل البيانات. (A DAF ± SE، ترك محور Y) في ECS في ظل الظروف القاعدية وبعد التعرض لاعبي التنس المحترفين. وNO معدل الإنتاج (مدافع / دينارا، خط منقط)، وقد اشتق من تحويل التفاضلية الأول من FI DAF المتراكم (الصحيح محور Y). (ب) صور الممثل من تجربة واحدة. زيادة FI DAF أكثر بعد ذلك، تم إضافة NO المانحة نتروبروسيد الصوديوم (SNP)، إلى الإرواء، مما يدل على كمية كافية من الخلايا DAF-2 للتفاعل مع NO. هذا هو الرقم المنشور سابقا 5. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة، نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتطوير شبكة microvessel مثقف، توصيف تقاطعات EC والهيكل الخلوي توزيع F-الأكتين، والقياسات الكمية من المفوضية الأوروبية [كا 2+] i و NO الإنتاج باستخدام جهاز ميكروفلويديك. ويوفر الجهاز ميكروفلويديك perfused نموذجا في المختبر أن يسمح للمحاكاة وثيقة من وهندستها الاوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي وظروف تدفق القص. منذ يمكن أن تتكون الشبكة microvessel مثقف من قبل ECS البشري الأساسي، وهذا النهج يمكن أن تكون بمثابة أداة مفيدة لمعرفة كيف مرضي مكونات الدم غيرت من عينات المرضى تؤثر ECS الإنسان التي نضح المباشر للعينات دم المرضى إلى microvessels مثقف وتوفير نظرة ثاقبة السريرية مسائل. ويمكن أيضا أن ECS الإنسان ضعت microvessels أن تستخدم لفحص المخدرات لتجنب الاختلافات المحتملة في الردود المخدرات بين الأنسجة البشرية والحيوانية.

ve_content "> الركيزة الأجهزة ميكروفلويديك هو مبين في هذا البروتوكول هو الغطاء الزجاجي للانزلاق (150-180 ميكرون) تدور المغلفة بطبقة رقيقة من PDMS. هذه الطبقة رقيقة من PDMS ضرورية لدقة عالية والأنسجة الحية في الوقت الحقيقي التصوير، لأن أهداف الفتحة العددية الكبيرة عادة ما العمل لمسافات قصيرة. تدفق الصفحي داخل متناهية (المدى submillimeter) لديها عدد رينولدز منخفضة جدا، ويرتبط الفرق في الضغط خطيا إلى تدفق، وبالتالي فإن توزيع إجهاد القص يعتمد فقط على هندسة القناة. لذلك، فإنه يمكن السيطرة عليها تماما من قبل عالية الدقة نضح ضخ 20. وفي الدراسة الحالية، كان إجهاد القص المطبقة على شبكة microvessel مثقف HUVEC بين 1 إلى 10 داين / سم 2، والتي تقع ضمن مجموعة من إجهاد القص تقاس في الجهاز الوريدي 21،22. إن أنظمة الكلية فلويديك مثل غرفة تدفق موازية يفتقر إلى أنماط تدفق المعقدة. في جو من غرف تدفق حجم (مم سم مجموعة)، ECS عادة ما تزرع فقط في السطح السفلي (2D أحادي الطبقة)، وتفتقر إلى أوجه التشابه الهندسية لmicrovessels في الجسم الحي. عندما عرض غرفة تدفق أكثر من 2 ملم، يقتصر تدفق متجانسة في المنطقة التي عادة ما تكون عدة مليمترات بعيدا عن مخرج / مدخل، وبضعة ميكرونات بعيدا عن الجدار الجانبي 23 مئة. عند زيادة العرض من غرفة إلى مجموعة من سم، وتدفق تفرق في مختلف يبسط وسوف سرعات التدفق يتغير عبر المنطقة كلها 24. بالإضافة إلى ذلك، غرفة التدفق على نطاق أوسع تستهلك على الأقل 100 مرة أكثر الإرواء لتحقيق نفس إجهاد القص كما أنه في microchannels. توزيع إجهاد القص داخل الشبكة متناهية يمكن محاكاة باستخدام أداة النمذجة العددية، ومعادلات نافيير ستوكس ينضغط ثابتة لا يمكن حلها من قبل معظم البرامج عنصر محدود.

الجهاز ميكروفلويديك يمكن أن يتم مع سينغله عملية قناع التصنيع الدقيق. نجاح التنمية microvessel مثقف، ومع ذلك، يتطلب الانتباه خاصة إلى التفاصيل. بعد تحميل الحل في و microchannels، يحتاج كل جهاز إلى أن يتم التحقق لمحاصرة فقاعة تحت المجهر قبل البذر EC. في حالة حدوث فقاعة، فإنه لا يزال من الممكن إجبار من ذلك في هذه المرحلة من خلال تطبيق الضغط الهيدروليكي عند مدخل مع منفذ مغلق، كما PDMS هو مادة قابلة للاختراق الهواء. للحفاظ على معدل نضح المطلوب، ضيقة دون تسرب ضروري لكافة الاتصالات إبرة / أنابيب. ويقابل ثقب الناخس وحجم أنابيب حاسمة لتحقيق ضيقة. لضمان تسليم الدقيق للمعدل التدفق، يجب وضع الحقنة على مضخة نضح والجهاز على نفس المستوى. لتغيير الإرواء، وأنابيب إدراج يجب أن تكون منفصلة بلطف من الجهاز لتجنب أي التمدد. لزيادة إجهاد القص، ويزيد من خطوة (مثل 10 خطوات لزيادة في 18 ساعة) هي recommenدائرة التنمية الاقتصادية لتجنب تغير التدفق المفاجئ تسبب تقشير EC.

وأشارت دراسات سابقة أجريت على microvessels سليمة perfused بشكل فردي أن الزيادات الناجمة عن ناهض في المفوضية الأوروبية [كا 2+] ط، وما تلاه البطانية سينسيز أكسيد النيتريك (أنوش) تفعيل وأي إنتاج والإشارات اللازمة لزيادة نفاذية الاوعية الدموية الدقيقة في ظل ظروف التهابات 6،7 ، 9-13،25. في هذا البروتوكول، ونحن حدد ATP كما ناهض التمثيلي، منذ إصدارها عادة من قبل خلايا الدم الحمراء والصفائح الدموية المجمعة، والأنسجة جرح أو في ظل ظروف التهابات في الجسم الحي. مؤشر الكالسيوم مضان، فلوو-04:00، وكان يستخدم لقياس التغيرات في البطانية [كا 2+] أنا بعد التعرض لاعبي التنس المحترفين. المفوضية الأوروبية [كا 2+] ط الردود في microvessels مثقف مماثلة لتلك التي وجدت في microvessels سليمة 7،9. كان قياس الإنتاج في المجموعة الأوروبية NO تحديا تقنيا لعلماء الأحياء.حتى الآن، لم يكن هناك أي مؤشر الفلورسنت التي تمكن من الكشف عن التغيرات الديناميكية في NO تركيز بطريقة مماثلة للمؤشرات الكالسيوم. وقد استخدم DAF-2 DA على نطاق واسع لتقييم أي إنتاج. ومع ذلك، فإن الاستخدام السليم، وتفسير البيانات، وتحليل البيانات تحتاج إلى جذب انتباه المستخدمين. منذ التحول الكيميائي للDAF-2 DAF-2T في وجود لا لا رجعة فيه (ذهاب التحويل) 26، وDAF ملف كثافة مضان الكشف لا تمثل التغييرات في NO التركيز. بدلا من ذلك، يشير إلى تراكم إنتاج DAF-2T مع مرور الوقت. وبناء على هذا المتراكمة DAF-2 مضان (FI DAF) منحنى، وNO معدل الإنتاج (مدافع / دينارا) يمكن استخلاصها من تحويل التفاضلية الأول من FI DAF 7،11. وهي، المنحدر من منحنى FI يشير إلى معدل إنتاج NO ويشير إلى مرحلة الهضبة أبعد زاد NO الإنتاج. بعد التحويل، ولدت البيانات من هذا البروتوكول والعلاقات العامةesented كل من القاعدية NO معدل الإنتاج والتغيرات في أي إنتاج في استجابة لاعبي التنس المحترفين مع القرار الزماني والمكاني في مستويات EC الفردية داخل الشبكة microvessel.

حاليا تم استخدامها PDMS على نطاق واسع لتطبيقات الموائع الدقيقة، كما هو شفافة بصريا، غير سام، والغاز قابلة للاختراق المطاط الصناعي لينة 27-30. ومع ذلك، منذ PDMS ليس نفاذية المياه، لم نتمكن من قياس مباشرة نفاذية أحادي الطبقة EC. للتغلب على هذا القيد، بعض التطبيقات تعديل الهياكل قناة جدار مثل دمج نفاذية الغشاء في قناة 31، أو إنشاء قابلة للاختراق "فتحات النوافذ" مع أعمدة صغيرة أو الثقوب الدقيقة 32،33، في حين أن البعض الآخر قد ركزت على تعديل مواد لصنع العبوات مثل استخدام الأجهزة هيدروجيل أو هيدروجيل / الأجهزة الهجينة PDMS 17،34-36. عيوب هذه الأجهزة هي الطبيعة الهشة لالجفاف ومن م ضعيف نسبياخصائص echanical للوقوف الإجهاد أو الضغط. سوف التنمية المستقبلية للمادة قابلة للاختراق مع القوة الميكانيكية زيادة تحسين الجهاز وقدرته على التطبيقات البيولوجية على نطاق أوسع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم المصالح المتنافسة أو المصالح المتضاربة في الكشف عنها.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل القومي للقلب والرئة والدم المعهد يمنح HL56237، المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى معهد DK97391-03، ومؤسسة العلوم الوطنية (NSF-1227359 وEPS-1003907).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATP Sigma-Aldrich A2383
Acetone Fisher Scientific A929
Biopsy punch Miltex 33-31 AA
Bovine Albumin MP Biomedicals 810014
Bovine Brain Extract (BBE) Lonza CC-4098
Cover-slip Fisher Scientific 12-542C
DAF-2 DA Calbiochem 251505
Dextran Sigma-Aldrich 31390
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody Life technologies A-11055
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-250
DRAQ5 (nuclei staining)  Cell Signaling Technology 4084
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) Sigma-Aldrich E2759-15MG
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Fibronectin Gibco PHE0023
Fluo-4 AM Life technologies F-14201
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890-100G
Gentamicin (50 mg/ml) Gibco 15750-078
Glass coverslip Fisher Scientific 12-548B
Glass Pasteur pippette VWR 14672
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3393-10KU
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) Lonza CC-2517
Isopropyl alcohol (IPA) VWR 89125
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030-081
Mammalian Ringer Solution Ingredient
NaCl (132 mM) Fisher Scientific S671-3
KCl (4.6 mM) Fisher Scientific P217-500
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) Fisher Scientific C79-500
MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) Fisher Scientific M63-500
Glucose (5.5 mM) Fisher Scientific BP350-1
NaHCO3 (5.0 mM) Fisher Scientific S233-500
Hepes Salt (9.1 mM) Research Organics 6007H
Hepes Acid (10.9 mM) Research Organics 6003H
MCDB 131 Culture Medium Life technologies 10372-019
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phalloidin (F-actin staining) Sigma-Aldrich P1951
Phosphate Buffered Saline  Life technologies 14040-133
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Corporation Sylgard 184
Scalpel Exel Int 29552
Scotch tape 3M 34-8711-3070-3
Silicon wafer VWR 14672
SU-8 photoresist MicroChem SU-8 2050 Y111072
SU-8 developer MicroChem Y020100
tissue culture flasks Sigma-Aldrich Z707503-100EA
Triton X-100 Chemical Book T6878
Trypsin Neutralizer solution Gibco R-002-100
Trypsin/EDTA Solution (TE) Gibco R-001-100
Tubing Cole-Parmer PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD
VE-cadherin Santa Cruz Biotechnology SC-6458
Name of Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Biosafety Laminar hood NuAire NU-425 Class II, Type A2
CCD camera Hamamatsu ORCA
Confocal microscope Leica TCS SL
Desiccator Bel-Art F42022
Hotplate Wenesco HP-1212
Incubator Forma Scientific 3110
Isotemp oven Barnstead 3608-5
Lithography bench Karl Suss MA6 Contact Lithography
Optical microscope Nikon L200 ND & Diaphod 300
Shutter for the CCD camera Sutter Instrument Lambda 10-2
Plasma cleaner PVA TePla/Harrick plasma M4L/PDC-32G
Spin coater Brewer Science Cee 200X
Syringe pump system Harvard Apparatus 703005
Name of Software Company Catalog Number Comments/Description
CAD software Autodesk AutoCAD 2015
CFD simulation software COMSOL COMSOL Multiphysics 4.0.0.982
Images acquire and analyse for NO production  Universal Imaging Metafluor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).
  3. Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater Today. 8, 50-56 (2005).
  4. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
  5. Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797 (2015).
  6. He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
  7. Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
  8. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  9. He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
  10. Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
  11. Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
  12. He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
  13. He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
  14. Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
  15. Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
  16. Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
  17. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
  18. D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
  19. Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
  20. Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
  21. Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
  22. Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
  23. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
  24. McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
  25. Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
  26. Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
  27. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  28. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
  29. Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
  30. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).
  31. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).
  32. Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  33. Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
  34. Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
  35. Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
  36. Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).

Tags

البيولوجيا الخلوية، العدد 111، Microvessel، خلية البطانية، الكالسيوم داخل الخلايا، وأكسيد النيتريك، VE كادهيرين، F-الأكتين، على microfluidics
تطوير وتوصيف<em&gt; في المختبر</em&gt; شبكة Microvessel والقياسات الكمية من غشائي [كا<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; ط</sub&gt; والنيتريك إنتاج أكسيد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, S., Li, X., Liu, Y., He, P.… More

Xu, S., Li, X., Liu, Y., He, P. Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production. J. Vis. Exp. (111), e54014, doi:10.3791/54014 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter