Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System
Summary
This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).
Abstract
The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.
Introduction
Una tecnica saggio cella singola high-throughput recentemente sviluppato permette nuovi enzimi per essere sottoposti a screening da una libreria genetica su larga scala in base alla loro attività funzionali 1. A livello di singola cellula, proteine regolatrici della trascrizione sono impiegati per attivare l'espressione del gene reporter rilevando piccole molecole che sono prodotte come risultato di un'attività enzima bersaglio. Un primo approccio coinvolto l'isolamento di un operone fenolo-degradanti da Ralstonia eutropha E2 utilizzando l'espressione genetica substrato indotta metodo di retinatura (SIGEX), in cui il substrato induce l'espressione di una proteina reporter 2. Nhar di Pseudomonas putida è stato utilizzato per selezionare benzaldeide deidrogenasi 3, e LysG dal Corynebacterium glutamicum è stato utilizzato per lo screening high-throughput di un nuovo ceppo di L-lisina-produzione da diverse librerie di mutanti 4.
In precedenza, un enzima screeni geneticaSistema ng (GESS) è stata proposta come una piattaforma di screening generalmente applicabile 5. Questo sistema utilizza il regolatore dimetilfenolo fenolo-riconoscimento, DMPR, di P. putida. DMPR (E135K), e un mutante di DMPR, possono anche essere impiegati in GESS (pNP-GESS) per la rilevazione di p -nitrophenol (pNP). In presenza di enzimi bersaglio producono composti fenolici, GESS in E. coli emette un segnale di fluorescenza, consentendo il rapido isolamento di singole cellule utilizzando un cell sorter fluorescenza attivate (FACS). Ma l'espressione di enzima metagenomico sembra essere più debole di quella degli enzimi ricombinanti convenzionali; Pertanto, GESS è stato progettato per rilevare composti fenolici con la massima sensibilità per indagare la combinazione di ribosomiale sito di legame (RBS) e sequenze di terminazione con ottimali condizioni di funzionamento 5.
Uno dei vantaggi fondamentali del GESS è che questo metodo unico permette teoricamente la proiezione di over di 200 diversi tipi di enzimi nel database BRENDA (Tabella 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) semplicemente utilizzando substrati diversi. E 'stato dimostrato che cellulasi, lipasi, e metil parathion idrolasi (MPH) può essere rilevato tramite PNP-GESS con substrati appropriati di p -nitrophenyl butirrato, p -nitrophenyl-cellotrioside, e parathion metile, rispettivamente, 5. Recentemente, è stato dimostrato che una fosfatasi alcalina (AP), che è uno dei nuovi enzimi identificate utilizzando pNP-GESS, è il primo AP termolabile trovato in metagenomi marini adattati freddo 6.
Qui, i dettagli del processo di screening è presentato con PNP-GESS rilevare le attività di tre diversi tipi di lipasi enzymes-, cellulasi, e fosfatasi alcalina -e identificare rapidamente nuovi enzimi candidati da una libreria metagenomica 5,6. I processi includono metagenoma pre-elaborazione con PNP-GESS e la gestione di un flOW citometria sorter. Mentre dovranno essere sequenziato per ulteriore identificazione i successi ottenuti, questo protocollo riguarda la procedura fino ai gradini di conferma dell'attività enzimatica citometria a flusso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aumentare l'efficienza della produzione di biocatalizzatori è una chiave per il successo di bio-chimico a base industria 9 e metagenoma è considerato uno dei migliori fonte enzima naturale. In questo senso, è essenziale lo screening di nuovi enzimi dalla metagenome dove la maggioranza delle risorse genetiche non sono state esplorate 10. Diversi metodi di screening sono stati sviluppati che rilevano direttamente i prodotti enzimatici utilizzando attivatori trascrizionali 11, 12 ma …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-mL conical tube | BD Falcon | ||
| 14-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria- Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L |
| Cell storage media | 2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
Referências
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