Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento
Summary
This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).
Abstract
The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.
Introduction
Un alto rendimiento de técnica de ensayo de una sola célula recientemente desarrollado permite nuevas enzimas que se proyectarán partir de una biblioteca genética a gran escala en base a sus actividades funcionales 1. En el nivel de células individuales, se emplean las proteínas que regulan la transcripción para activar la expresión de genes reportero mediante la detección de moléculas pequeñas que se producen como resultado de una actividad de la enzima objetivo. Un enfoque temprano implicado el aislamiento de un operón de fenol-degradante de Ralstonia eutropha E2 utilizando la expresión genética sustrato inducida método (SIGEX), en el que el sustrato induce la expresión de una proteína indicadora 2 de cribado. Nhar de Pseudomonas putida se utilizó para seleccionar benzaldehído deshidrogenasa 3, y LysG de Corynebacterium glutamicum se utilizó para el cribado de alto rendimiento de una nueva cepa L-lisina productoras de diversas bibliotecas mutantes 4.
Anteriormente, una enzima genética screeniSe propuso sistema ng (GESS) como una plataforma de cribado de aplicación general 5. Este sistema utiliza el regulador dimetilfenol fenol-reconocer, DMPR, de P. putida. DMPR (E135K), y un mutante de DMPR, también se pueden emplear en GESS (PNP-GESS) para la detección de nitrofenol p (PNP). En presencia de enzimas objetivo la producción de compuestos fenólicos, GESS en E. células de E. coli emite una señal de fluorescencia, lo que permite el aislamiento rápido de células individuales utilizando un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). Sin embargo, la expresión de la enzima metagenomic parece ser más débil que la de las enzimas recombinantes convencionales; Por lo tanto, GESS fue diseñado para detectar compuestos fenólicos con la máxima sensibilidad mediante la investigación de la combinación de sitio de unión ribosomal (RBS) y las secuencias de terminación junto con condiciones de funcionamiento óptimas 5.
Una de las ventajas fundamentales de GESS es que este único método permite, teóricamente, la proyección de over de 200 tipos diferentes de enzimas en la base de datos BRENDA (Tabla 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) simplemente empleando diferentes sustratos. Se demostró que la celulasa, lipasa, y hidrolasa metil paratión (MPH) se puede detectar usando PNP-GESS con sustratos apropiados de p-nitrofenil butirato, p-nitrofenil-cellotrioside, y metil paratión, respectivamente 5. Recientemente, se demostró que una fosfatasa alcalina (AP), que es una de las nuevas enzimas identificadas usando PNP-GESS, es la primera AP termolábil que se encuentra en metagenomes marinos adaptados al frío 6.
Aquí, los detalles del proceso de selección se presenta con PNP-GESS detectar las actividades de tres diferentes tipos de lipasa enzymes-, celulasa, y fosfatasa alcalina -y la identificación de nuevas enzimas candidatos a partir de una biblioteca metagenómica 5,6 rápidamente. Los procesos incluyen metagenoma procesamiento previo con PNP-GESS y operar un flclasificador de flujo citometría. Mientras que los éxitos obtenidos tendrán que ser secuenciado para su posterior identificación, este protocolo cubre el procedimiento hasta los pasos de confirmación de la actividad enzimática mediante citometría de flujo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aumento de la eficiencia de producción de biocatalizadores es una clave para el éxito de la bio-químico basado en la industria de metagenome 9 y está considerada como una de las mejores fuentes de enzimas naturales. En este sentido, es esencial para el cribado de nuevas enzimas metagenoma donde la mayoría de los recursos genéticos no se han explorado 10. Varios métodos de detección se han desarrollado que detectan directamente los productos de enzimas utilizando activadores de la transcr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-mL conical tube | BD Falcon | ||
| 14-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria- Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L |
| Cell storage media | 2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
Referências
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