멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영
Summary
This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).
Abstract
The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.
Introduction
최근에 개발 된 높은 처리량 단일 세포 분석 기법은 신규 효소는 기능적 활동을 기반으로 한 대규모 유전자 라이브러리로부터 스크리닝 될 수있다. 단일 세포 수준에서 전사 조절 단백질을 표적 효소 활성의 결과로 생산되는 작은 분자를 감지하여 리포터 유전자의 발현을 유발하기 위해 사용된다. 초기의 방법은 상기 기판은 리포터 단백질이 발현을 유도하는 (SIGEX) 메소드를 스크리닝 기판 – 유도 유전자 발현을 사용 Ralstonia eutropha E2로부터 페놀 분해 오페론의 분리를 포함했다. 슈도모나스 푸티 다 (Pseudomonas putida)의 NhaR은 알데하이드 탈수소 효소 (3)을 선택하기 위해 사용하고, 코리 네 박테 리움 글루 타미 쿰에서 LysG은 다양한 돌연변이 라이브러리 (4)로부터 새로운 L- 라이신 생산 균주의 고 처리량 스크리닝에 이용 하였다.
이전에는 유전 적 효소 screeniNG 시스템 (GESS)는 일반적으로 적용 선별 플랫폼 (5)로 제안되었다. 이 시스템의 P., DmpR을 페놀 인식 디메틸 레귤레이터를 사용 푸티 다. DmpR (E135K) 및 DmpR의 돌연변이는 또한 P의 니트로 페놀 (PNP)의 검출 GESS (PNP-GESS)에 사용될 수있다. 페놀 성 화합물의 제조 표적 효소의 존재에 GESS E. 대장균 세포는 형광 활성화 된 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 단일 세포의 신속한 분리를 가능하게하는 형광 신호를 방출한다. 그러나 군 유전체학 효소의 발현은 통상적 인 재조합 효소보다 약한 것으로 보인다; 따라서 GESS 최적의 운전 조건과 함께 5 리보솜 결합 부위 (RBS) 및 종료 서열의 조합을 조사하여 최대 감도와 페놀 성 화합물을 검출하도록 설계되었다.
GESS의 기본적인 장점 중 하나는이 하나의 방법은 이론적으로 오븐의 심사를 수 있다는 것입니다BRENDA 데이터베이스에있는 효소의 어 200 다양한 유형 (표 1에 http : // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) 단순히 다른 기판을 사용함으로써. 그것은 그 셀룰라 제, 리파제를 도시하고, 메틸 파라티온 가수 분해 효소 (MPH)의 P의 -nitrophenyl 부티레이트, P의 -nitrophenyl-cellotrioside, 메틸 파라티온, 각각 5 적절한 기질 PNP-GESS을 이용하여 검출 될 수있다. 최근에는 PNP-GESS를 사용하여 식별 소설 효소의 하나 인 알칼리성 포스파타제 (AP)가, 추위 적응 해양 metagenomes 6에서 발견 된 첫 번째 thermolabile의 AP는 것을 입증했다.
여기서, 검사 공정의 상세 PNP-GESS는 5,6- 군 유전체학 라이브러리로부터 새로운 후보 효소를 빠르게 식별 enzymes- 리파아제, 셀룰라아제, 알칼리 포스파타제의 세 가지 유형의 활동을 검출 -and되게된다. 프로세스는 metagenome PNP-GESS로 전처리 및 FL을 운영 포함세포 계측법 분류기를 흐름. 얻은 히트 더 식별 순서가 될 필요가 있지만,이 프로토콜은 유동 세포 계측법 사용하여 효소 활성을 확인하는 단계까지의 절차를 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생체 촉매의 생산 효율을 증가시키는 것은 가장 좋은 천연 효소 소스로 간주됩니다 산업 9 metagenome 기반 바이오 화학의 성공을위한 열쇠입니다. 이러한 의미에서, 그것은 유전자 원의 대부분이 10 탐험되지 않은 metagenome에서 새로운 효소를 선별하는 것이 필수적입니다. 몇몇 선별 방법은 직접 전사 활성화 제 11, 12를 사용하여 효소 제품을 검출하는 개발되어 있지만, 이들 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-mL conical tube | BD Falcon | ||
| 14-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria- Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L |
| Cell storage media | 2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
Referências
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