Multi-enzym Screening med hjälp av en hög kapacitet Genetic Enzyme Screening System
Summary
This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).
Abstract
The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.
Introduction
En nyligen utvecklad hög genomströmning single-cellanalys teknik tillåter nya enzymer som skall screenas från en storskalig genetiska bibliotek baserat på deras funktionella aktiviteter 1. Vid den enda cellnivå, är proteiner som reglerar transkription som används för att utlösa reportergenuttryckning genom att avkänna små molekyler som produceras som ett resultat av en mål-enzymaktivitet. En tidig metod involverade isolering av en fenol-nedbrytande operonet från Ralstonia eutropha E2 användning av substratet-inducerade genetiskt uttryck screening metoden (SIGEX), i vilken substratet leder till uttryck av ett reporterprotein 2. NHAr av Pseudomonas putida användes för att välja bensaldehyd dehydrogenas 3, och LysG från Corynebacterium glutamicum användes för high-throughput screening av ett nytt L-lysin-producerande stam från olika mutantbibliotek 4.
Tidigare en genetisk enzym screening-systemet (GESS) föreslogs som en allmängiltig screening plattform 5. Detta system använder fenol igenkännande dimetylfenol regulator, DmpR, P. putida. DmpR (E135K), och en mutant av DmpR, kan också användas i GESS (pNP-GESS) för detektering av p-nitrofenol (PNP). I närvaro av målenzymer producerar fenolföreningar, GESS i E. coli-celler emitterar en fluorescenssignal, vilket möjliggör snabb isolering av enskilda celler med användning av en fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS). Men uttrycket av metagenomic enzym verkar vara svagare än konventionella rekombinanta enzymer; Därför var GESS utformad för att upptäcka fenolföreningar med maximal känslighet genom att undersöka kombinationen av ribosomalt bindningsställe (RBS) och terminatorsekvenser tillsammans med optimal driftstillstånd 5.
En av de grundläggande fördelarna med GESS är att denna enda metod tillåter teoretiskt screening av over än 200 olika typer av enzymer i BRENDA databas (Tabell 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) genom att helt enkelt anställa olika substrat. Det visades att cellulas, lipas, och metylparation hydrolas (MPH) kan detekteras med användning pNP-GESS med lämpliga substrat av p-nitrofenyl butyrat, p-nitrofenyl-cellotrioside, och metylparation, respektive 5. Nyligen var det visat sig att ett alkaliskt fosfatas (AP), som är ett av de nya enzymerna identifierade med användning av pNP-GESS, är den första termolabila AP hittas i kall anpassad marina metagenomes 6.
Här, detaljer av genomgången presenteras med pNP-GESS upptäcka verksamheten i tre olika typer av enzymes- lipas, cellulas, och alkalisk fosfatas -och snabbt identifiera nya kandidat enzymer från en metagenomic bibliotek 5,6. Processerna omfattar metagenome förbehandling med pNP-GESS och driva en flow cytometry sorterare. Medan träffar som erhållits kommer att behöva sekvenseras för ytterligare identifiering, detta protokoll omfattar förfarandet fram till stegen enzymaktivitet bekräftelse med hjälp av flödescytometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ökad produktionseffektivitet av biokatalysatorer är en nyckel för att lyckas med biokemiska baserad industri 9 och metagenome anses vara en av de bästa naturliga enzymkälla. I denna mening är det viktigt att screening nya enzymer från metagenome där majoriteten av de genetiska resurserna inte har undersökts 10. Flera screeningmetoder har utvecklats, vilka direkt detekterar enzymprodukter med hjälp av transkriptionsaktivatorer 11, 12 men dessa tekniker kräver specifik metabolit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-mL conical tube | BD Falcon | ||
| 14-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria- Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L |
| Cell storage media | 2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
Referências
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. Novel screening methods-biosensors. Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
