No restricción EEG radiotelemetría: epidural y Deep intracerebral estereotáxica colocación de electrodos EEG
Summary
No de restricción EEG radiotelemetría es un enfoque metodológico valioso para grabar electroencefalogramas a largo plazo in vivo de los roedores con libertad de movimientos. Este protocolo detallado describe epidural estereotáxica y colocación de los electrodos intracerebral profunda en diferentes regiones del cerebro con el fin de obtener registros fiables de la ritmicidad del SNC y las etapas de comportamiento relacionadas con el SNC.
Abstract
Implantable radio telemetría EEG es de importancia central en la caracterización neurológica de los modelos de ratones transgénicos de enfermedades neuropsiquiátricas y neurodegenerativas, así como las epilepsias. Esta poderosa técnica no sólo proporcionan información valiosa sobre los mecanismos fisiopatológicos subyacentes, es decir., La etiopatogenia de las enfermedades relacionadas con el SNC, sino que también facilita el desarrollo de nuevos traslacional, es decir., Enfoques terapéuticos. Mientras que las técnicas de la competencia que hacen uso de sistemas de grabación utilizados en las chaquetas o los sistemas atados sufren de su alejamiento no fisiológica de carácter semi-restricción, los registros de EEG radiotelemétrico superar estos inconvenientes. Técnicamente, la radiotelemetría implantable EEG permite la medición precisa y altamente sensible de EEG epidurales y profundo, intracerebrales en diversas condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. En primer lugar, se presenta un protocolo detallado de una recta hacia adelante, con éxito,técnica rápida y eficaz para las grabaciones epidural (superficie) de EEG resultantes en electrocorticograms de alta calidad. En segundo lugar, demostramos cómo implantar electrodos de EEG, intracerebrales profundos, por ejemplo, en el hipocampo (electrohippocampogram). Para ambos enfoques, se utiliza un sistema de electrodos 3D implantación estereotáxica computarizado. El transmisor de radiofrecuencia sí mismo se implanta en una bolsa subcutánea en ratones y ratas. Especial atención también tiene que ser pagado a la pre-, peri- y el tratamiento postoperatorio de los animales de experimentación. La preparación preoperatoria de los ratones y las ratas, anestesia adecuadas, así como la gestión del tratamiento del dolor postoperatorio y se describen en detalle.
Introduction
Radiotelemetría es un enfoque metodológico más valioso para medir una variedad de parámetros de comportamiento y fisiológicos en animales, sin restricciones conscientes de diferentes tamaños, en particular en el contexto de EEG, ECG, EMG, la presión arterial, la temperatura corporal central o mediciones de la actividad 1-7. En teoría, cualquier especie se pueden analizar usando radiotelemetría implantable EEG de los roedores de laboratorio, tales como ratones y ratas a gatos, perros, cerdos y primates 3,8. Incluso los peces, reptiles y anfibios están sujetas a investigación radiotelemétrico 9. Durante las dos últimas décadas, implantable de radiotelemetría EEG ha demostrado ser valiosa en la caracterización de los diversos modelos de animales transgénicos de enfermedades humanas, tales como epilepsias, trastornos del sueño, trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos 7,10-12. En el pasado, numerosos enfoques metodológicos que recogen datos fisiológicos incluyendo biopotenciales de ratones y ratas han sido descRibed. Usado en los sistemas de la chaqueta de la grabadora, métodos de sujeción mecánica, radiotransmisores no implantados y sistemas atados han recibido la atención principal en el pasado 13,14. Hoy en día, varios sistemas para la implantación radiotelemétrico están disponibles comercialmente. Sin embargo, una pantalla literatura también reveló 29 publicaciones que describen el desarrollo de sistemas radiotelemétrico hecho a sí mismo 15-40. Mientras que los sistemas caseros son propensos a ser menos costoso y más fácil de adaptar, comercialmente disponibles son sistemas sencillo, relativamente fácil de instalar y se puede configurar de forma rápida.
Implantable radio telemetría EEG tiene una serie de ventajas en comparación con las técnicas de competencia, tales como los métodos de coerción física, que se llevan en los sistemas de la chaqueta o enfoques atados. Estos últimos son de restricción, por definición, es decir., El animal es incapaz de moverse o su comportamiento normal se ve afectada. Incluso podría ser necesario anestesiar al animal para la adquisición de nuevoDatos sujetos. Los sistemas modernos atados sin embargo es probable que sean menos restrictiva, pero esto tiene que ser validado científicamente. Radiotelemetría por otra parte permite a los animales exhiben su completo repertorio de comportamiento sin restricciones espacio-temporales y, por tanto, se cree que es superior a la sujeción de los enfoques y ser más predictivo de los resultados que podrían ser adquiridos en los seres humanos 1,3. Es conocido por bastante tiempo que los enfoques de restricción pueden alterar dramáticamente los parámetros fisiológicos fundamentales, por ejemplo., La ingesta de alimentos, la temperatura corporal, la presión arterial y la frecuencia cardíaca y la actividad física para el ejemplo 3. Sistemas atados representan enfoque todavía ampliamente utilizado de restricción clásica 13,14. Los electrodos que son los electrodos, ya sea epidural o profundas son generalmente conectados a una toma de miniatura que se ancla al cráneo. La toma en sí está expuesta para la fijación de un cable que permite relativamente libre movimiento del animal. Although hoy en día sistemas atados se han vuelto extremadamente filigrana y altamente flexible, una de sus principales desventajas es decir, que todavía es semi-restricción. Además, puede haber un riesgo de infección en el sitio de la implantación de electrodos como los animales tienden a manipular los dispositivos externos se derivan de su cuerpo (cabeza). Aunque la tecnología de radio telemetría inalámbrica en varias especies ya se ha descrito en los años 60 y por lo tanto ha existido durante décadas, se ha convertido recientemente asequible, fiable y relativamente fácil de usar 10,41,42, en particular en los pequeños roedores de laboratorio tales como ratones y ratas. Pequeñas, miniatura transmisores EEG implantables ahora están disponibles comercialmente y pueden ser implantados en ratones de más de 20 g (~ 10 semanas). Por lo tanto, la caracterización electrofisiológica de modelos de ratones transgénicos, en particular, se ha convertido en un campo predominante de aplicación de radiotelemetría implantable EEG estos días. tamaño del animal ya no es una restric experimental absolutación, mientras que la vida útil de la batería del transmisor, de hecho lo es. A pesar de su limitado tiempo de vida, sistemas de transmisión implantables son capaces de reducir al mínimo la mayoría de los inconvenientes relacionados con el estrés potencial grabación asociada a los sistemas de contención. Los roedores pueden presentar su arsenal completo de comportamiento fisiológico que incluye reposo, la actividad locomotora (exploración) y sueño (REM, sueño de ondas lentas) 43,44. Es importante destacar que, radiotelemetría implantable puede reducir fuertemente el uso de animales 3. En la actualidad, existe una intensa discusión sobre la manera de limitar el número de animales de experimentación en la ciencia y reducir su sufrimiento. Claramente, la experimentación con animales y modelos animales de enfermedades humanas y animales son esenciales para la comprensión de la fisiopatología línea de fondo y el posterior progreso en la terapia. Por otra parte, los experimentos con animales son críticos en la investigación y desarrollo de fármacos. Ellos contribuyen sustancialmente a los estudios preclínicos / toxicológicos en la concesión de licencias de drogascomprometiéndose así tanto a la asistencia humana y animal. Es de destacar, que en la actualidad no existen alternativas están disponibles para la investigación con animales para entender los mecanismos fisiopatológicos complejos, que de otro modo serían imposibles de ser despertado. Al mismo tiempo, el 3R, es decir., Reemplazo, reducción y refinamiento en la estrategia de la UE y los EE.UU. alienta fuertemente la investigación sobre los métodos complementarios y alternativos. Radiotelemetría es un ejemplo importante de una estrategia 3R éxito, ya que puede reducir el número de animales de experimentación y su sufrimiento en comparación con otras técnicas.
Aquí proporcionamos un enfoque detallado y contiguo paso a paso para llevar a cabo una implantación subcutánea de la bolsa de un transmisor de radiofrecuencia tanto en ratones y ratas. Esta primera secuencia es seguida por una descripción de epidural estereotáxico y profundo intracerebral colocación de los electrodos EEG. Se presta especial atención a las condiciones de vivienda, anestesia, peri y el dolor postoperatoriola gestión y el posible tratamiento anti-infeccioso. La atención se centra en el enfoque 3D estereotáxica computarizado para orientar de forma fiable las estructuras intracerebrales epidurales y profundos. También se comentan trampas experimentales frecuentes en la implantación de electrodos EEG y estrategias para la reducción del trauma y la optimización del manejo del dolor durante la recuperación postoperatoria. Por último, se presentan ejemplos de registros de EEG superficial y profunda.
Protocol
Representative Results
Discussion
Implantable radiotelemetría EEG es de importancia fundamental, ya que es una técnica no de restricción que permite animales de experimentación para llevar a cabo su completo repertorio de comportamiento 1,3. Esto es de gran interés como el enfoque telemétrico permite no sólo los registros de EEG espontáneo sino también grabaciones bajo tareas cognitivas y configuraciones de análisis circadianos, tales como T-laberinto, laberinto radial, laberinto de agua, las tareas de la privación del sueño o cua…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Christina Ginkel (German Center for Neurodegenerative Diseases, DZNE), Dr. Michaela Möhring (DZNE) and Dr. Robert Stark (DZNE) for assistance in animal breeding and animal health care. This work was financially supported by the Federal Institute for Drugs and Medical Devices (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM) Bonn, Germany.
Materials
| Carprofen (Rimadyl VET – InjektionA2:D43slösung) | Pfizer | PZN 0110208 | 20 ml |
| binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| bulldog serrefine | F.S.T. | 18051-28 | 28mm |
| cages (Macrolon) | Techniplast | 1264C, 1290D | |
| cold light source | Schott KL2500 LCD | 9.705 202 | ordered at Th.Geyer |
| cotton tip applicators (sterile) | Carl Roth | EH12.1 | |
| Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe) | Bayer | PZN: 1578818 | |
| drapes (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| 70% ethanol | Carl Roth | 9065.5 | |
| 0.3% / 3% hydrogene peroxide solution | Sigma | 95321 | 30% stock solution |
| gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| dental glas ionomer cement | KentDental /NORDENTA | 957 321 | |
| 2% glutaraldehyde solution | Sigma | G6257 | |
| Graefe Forceps-curved, serrated | F.S.T. | 11052-10 | |
| Halsey Micro Needle Holder-Tungsten Carbide | F.S.T. | 12500-12 | 12.5 cm |
| heat-based surgical instrument sterilizer | F.S.T. | 18000-50 | |
| heating pad | AEG HK5510 | 520010 | ordered at myToolStore |
| high-speed dental drill | Adeor | SI-1708 | |
| Iris scissors extra thin | F.S.T. | 14058-09 | 9 cm |
| Inhalation narcotic system (isoflurane) | Harvard Apparatus GmbH | 34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230 | |
| Isoflurane | Baxter 250 ml | PZN 6497131 | |
| Ketamine | Pfizer | PZN 07506004 | |
| lactated Ringer’s solution (sterile) | Braun | L7502 | |
| Lexar-Baby Scissors-straight, 10 cm | F.S.T. | 14078-10 | 10 cm |
| Nissl staining solution | Armin Baack | BAA31712159 | |
| non-absorbable suture material 5-0/6-0 (sterile) | SABANA (Sabafil) | N-63123-45 | |
| Covidien (Sofsilk) | S1172, S1173 | ||
| Halsey Needle Holder | F.S.T. | 12001-13 | 13 cm |
| pads (sterile) | ReWa Krankenhausbedarf | 2003/01 | |
| 0.9% saline (NaCl, sterile) | Braun | PZN:8609255 | |
| scalpel blades with handle (sterile) | propraxis | 2029/10 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12, 11000-14 | 12 cm and 14.5 cm length |
| Steel and tungsten electrodes parylene coated | FHC Inc., USA) | UEWLGESEANND | |
| stereotaxic frame | Neurostar | 51730M | ordered at Stoelting |
| (Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic) | |||
| tapes (sterile) | BSN medical GmbH & Co. KG | 626225 | |
| TA10ETA-F20 | DSI | 270-0042-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1-200 Hz, nominal sampling rate (f) 1000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34-41 °C warranted battery life 4 months |
| TL11M2-F20EET | DSI | 270-0124-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1-50 Hz, nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34-41 °C warranted battery life 1.5 months |
| Tissue Forceps- 1×2 Teeth 12 cm | F.S.T. | 11021-12 | 12 cm length |
| Tungsten carbide iris scissors | F.S.T. | 14558-11 | 11.5 cm |
| Vibroslicer 5000 MZ | Electron Microscopy Sciences | 5000-005 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | PZN: 1320422 |
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