الآلي الدهن طبقة ثنائية غشاء تشكيل باستخدام ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة
Summary
علينا أن نظهر، للنقل الدهون نظام تشكيل طبقة ثنائية القابل للتخزين. غشاء الدهون طبقة ثنائية يمكن أن تتشكل داخل 1 ساعة مع معدل نجاح أكثر من 80٪ عندما يتم إحضارها تمهيدا غشاء المجمدة إلى درجة حرارة الغرفة. وهذا النظام يقلل عمليات شاقة والخبرات ذات الصلة القنوات الأيونية.
Abstract
والدهون طبقة ثنائية مصطنعة، أو أسود الدهون غشاء (بلم)، هو أداة قوية لدراسة القنوات الأيونية والتفاعلات البروتينية، فضلا عن تطبيقات الاستشعار البيولوجي. ومع ذلك، وتقنيات تشكيل بلم التقليدية لها عدة عيوب وغالبا ما تتطلب خبرة معينة وعمليات شاقة. على وجه الخصوص، BLMs التقليدية تعاني من معدلات نجاح تشكيل منخفضة ويتعارض وقت تشكيل غشاء. هنا، علينا أن نظهر نظام تشكيل بلم القابل للتخزين ونقلها مع سيطرة الوقت ترقق بها وتعزيز معدل تشكيل بلم عن طريق استبدال الأفلام المستخدمة تقليديا (تترافلوروإيثيلين، polyoxymethylene، البوليسترين) إلى (PDMS) ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان. في هذه التجربة، يتم استخدام البوليمر التي يسهل اختراقها منظم مثل PDMS رقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، بدلا من المذيبات المستخدمة تقليديا مع اللزوجة المنخفضة، واستخدام السكوالين يسمح للرقابة الوقت رقيق خارجا عن طريق امتصاص المذيبات بطيء من قبل PDMS، وإطالة غشاء مدى الحياة. في الإعلانdition، باستخدام خليط من السكوالين وسداسي، وقد زاد من نقطة التجمد من الحل الدهون (~ 16 درجة مئوية)، بالإضافة إلى ذلك، تم إنتاج السلائف غشاء التي يمكن تخزينها لأجل غير مسمى ونقلها بسهولة. وقد خفضت هذه السلائف غشاء بلم وقت تشكيل <1 ساعة فيما حقق معدل تكوين بلم من ~ 80٪. وعلاوة على ذلك، أظهرت التجارب قناة أيون مع الجراميسيدين وجدوى نظام الأغشية.
Introduction
الاصطناعي الدهون غشاء طبقة ثنائية، أو أسود الدهون غشاء (بلم)، هو أداة هامة لتوضيح آليات أغشية الخلايا والقنوات الأيونية، وكذلك لفهم التفاعلات بين القنوات الأيونية وأيونات / جزيئات 1-7 على الرغم من أن طريقة التصحيح، المشبك وغالبا ما تعتبر المعيار الذهبي للدراسات غشاء الخلية، فمن شاقة وتتطلب مشغلي درجة عالية من المهارة لقياس القناة الايونية. 8 بينما ظهرت تشكيلها بشكل مصطنع الأغشية الدهنية طبقة ثنائية كأدوات بديلة للدراسات القناة الايونية، 9،10 أنها ترتبط أيضا مع شاقة عمليات وخبرات محددة. وعلاوة على ذلك، الأغشية عرضة للاضطرابات الميكانيكية. التطبيقات العملية وبالتالي، تقنيات طبقة ثنائية الدهون وعرض لتاريخ محدودة. 11
من أجل تعزيز متانة وطول العمر من الأغشية الدهنية طبقة ثنائية، كوستيلو وآخرون. 12، وإيد وياناغيدا <suص> 13 وقد وضعت طبقة ثنائية الدهن قائمة بذاتها بدعم من الهلاميات المائية. وعلى الرغم من تعزيز طول العمر ولكن (<24 ساعة)، لم تحسن طبقة ثنائية متانة. جيون وآخرون. 14 ضعت غشاء مغلف هيدروجيل (HEM) مع الحميم هيدروجيل الدهون طبقة ثنائية الاتصال، مما أدى إلى تعزيز طول العمر (تصل إلى عدة أيام). لزيادة عمر HEM، Malmstadt وجيون وآخرون خلق غشاء مغلف هيدروجيل مع هيدروجيل بالدهون ملزمة عبر في الموقع التساهمية الاقتران (cgHEM). 15 وفي كلا النظامين، وزيادة عمر غشاء كبير (> 10 يوما) . ومع ذلك، فإن أنظمة تشكيل غشاء يست قوية بما فيه الكفاية، وأنه لا يمكن تخزينها أو تسليمها عند الحاجة لتحرير الخبرة لاستخدام طبقات ثنائية الدهون.
وقد تمحور تطوير منصة الدهون طبقة ثنائية في المقام الأول حول زيادة متانة وطول العمر من BLMs. وبالرغم من أن طول عمر BLMs سوتعزيز bstantially مؤخرا، وقد اقتصرت طلباتهم بسبب عدم وجود قابلية النقل والقدرة التخزينية. للتغلب على هذه القضايا، جون وآخرون خلق نظام الغشاء القابل للتخزين وعرض السلائف غشاء (MP). 16 لبناء النائبة، وإعداد خليط من ديكان N- وسداسي تحتوي على 3٪ DPhPC (1،2-diphytanoyl- التعطيل -glycero-3-فسفاتيديل) للتحكم في درجة التجمد من الحل الدهون بحيث أنها ستجمد في ~ 14 درجة مئوية (تحت درجة حرارة الغرفة، وفوق درجة حرارة الثلاجة العادية). في هذه التجربة، تم نشر النائب خلال فتحة صغيرة على (PTFE) فيلم تترافلوروإيثيلين وجمدت في وقت لاحق في الثلاجة على 4 درجات مئوية. عندما أحضر النائب إلى درجة حرارة الغرفة، وإذابة النائب وتشكلت تلقائيا طبقة ثنائية المادة الدهنية، والقضاء على الخبرات التي ترتبط عادة مع تشكيل غشاء. ومع ذلك، كان معدل نجاح بلم مصنوعة من النائب منخفضة تصل إلى ~ 27٪، والتشكل الغشاءن الوقت كان يتعارض (30 دقيقة إلى 24 ساعة)، يحد من تطبيقاتها العملية.
في هذه الدراسة، تم استخدام ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) رقيقة بدلا من التقليدية لأغشية رقيقة مسعور (PTFE، polyoxymethylene، البوليسترين) إلى (أ) قياس الزمن تلفيق و (ب) زيادة معدل نجاح تشكيل بلم كما ذكرت سابقا من قبل ريو وآخرون. 17 وهنا، وقد سهلت تشكيل غشاء عن طريق استخراج المذيبات نظرا لطبيعة المسامية من PDMS، والوقت اللازم لتشكيل غشاء تمت السيطرة بنجاح في هذه الدراسة. في هذا النظام، كما استوعبت حل الدهون في الفيلم PDMS رقيقة، تم التوصل إلى ثابت وقت تشكيل غشاء. وعلاوة على ذلك، كان لفترة طويلة العمر الغشاء بسبب امتصاص بطيء من المذيبات في PDMS رقيقة، نتيجة لإضافة السكوالين إلى حل الدهون. أجرينا القياسات البصرية والكهربائية للتحقق من أن الأغشية شكلت باستخدام هذه التقنية هي مناسبة لطعلى دراسات القنوات.
Protocol
Representative Results
Discussion
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Materials
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534———-K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
Referências
- Hanke, W., Schulue, W. . Planar lipid bilayers: methods and applications. , (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
- Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
- Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
- Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
- Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
- Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
- Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
- Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
- Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
- Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
- Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
- Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
- Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
- Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
- Yaws, C. . Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , (1999).
- Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. . The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , (1976).
- Miller, C. . Ion Channel Reconstitution. , (1986).
- Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
- Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
- Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).
