Geautomatiseerde lipidebilaagmembraan Vorming Met behulp van een Polydimethylsiloxane Thin Film
Summary
We tonen een opgeslagen of vervoerd lipidedubbellaag formatie systeem. Een lipide dubbellaag membraan kan worden gevormd binnen 1 uur meer dan 80% succes als een bevroren membraan precursor tot omgevingstemperatuur wordt gebracht. Dit systeem tijdrovend proces en deskundigheid geassocieerd met ionkanalen verminderen.
Abstract
Een kunstmatige lipide dubbellaag of zwarte lipide membraan (BLM), is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van ionkanalen en eiwitinteracties alsook voor biosensor-toepassingen. Echter, conventionele BLM vorming technieken hebben een aantal nadelen en ze vereisen vaak specifieke expertise en tijdrovend proces. Met name de conventionele BLMs last hebben van lage formatie slagingspercentages en inconsistent membraan vorming van de tijd. Hier tonen we een houdbaar en transporteerbaar BLM formatie systeem met een gecontroleerde uitdunnen-out tijd en verbeterde BLM snelheid van vorming door het vervangen van conventioneel gebruikte films (polytetrafluorethyleen, polyoxymethyleen, polystyreen) naar polydimethylsiloxaan (PDMS). In dit experiment wordt een poreuze gestructureerd polymeer zoals PDMS gebruikte dunne. Bovendien, in tegenstelling tot gebruikelijke oplosmiddelen met lage viscositeit, het gebruik van squaleen toegelaten gecontroleerd uitdunnen tijd via slow oplosmiddelabsorptie door PDMS, verlengen membraanlevensduur. in addition, door toepassing van een mengsel van squaleen en hexadecaan, het vriespunt van het lipide-oplossing werd verhoogd (~ 16 ° C) bovendien membraan voorlopers werden geproduceerd die oneindig kan worden opgeslagen en gemakkelijk getransporteerd. Deze membraan voorlopers hebben BLM vorming van <1 uur gereduceerd en behaalde een BLM vorming tarief van ~ 80%. Bovendien ion channel experimenten met gramicidine A toonde de haalbaarheid van het membraan systeem.
Introduction
Kunstmatige lipide dubbellaag membraan of zwarte lipide membraan (BLM), is een belangrijk instrument voor het ophelderen van mechanismen van celmembranen en ionkanalen, alsmede voor het begrijpen van interacties tussen ionen ionenkanalen en / moleculen. 1-7 Hoewel de patch-clamp-methode wordt vaak beschouwd als de gouden standaard voor het celmembraan studies, is bewerkelijk en vereist zeer bekwame operators voor ionkanaal metingen. 8 Terwijl kunstmatig bereide lipide dubbellaag membranen zijn ontstaan als alternatieve instrumenten voor het ionkanaal studies, 9,10 ze worden ook geassocieerd met moeizame processen en specifieke deskundigheid. Bovendien membranen zijn gevoelig voor mechanische storingen. Daarom lipide bilaag technologieën die tot dusver beperkte praktische toepassingen. 11
Om de betrouwbaarheid en duurzaamheid van lipide dubbellaag membranen Costello et al. 12 en Ide en Yanagida verbeteren <sup> 13 hebben een vrijstaande lipidedubbellaag ondersteund door hydrogels bedacht. Ondanks de verbeterde levensduur echter (<24 uur), werd dubbellaag robuustheid niet verbeterd. Jeon et al. 14 bedacht een hydrogel ingekapseld membraan (HEM) met intieme hydrogel-lipide bilaag contact, wat resulteert in verhoogde levensduur (tot enkele dagen). Om de levensduur van de HEM verder te verhogen, Malmstadt en Jeon et al. Creëerde een hydrogel ingekapseld membraan met hydrogel-lipidebindende via in-situ covalente conjugatie (cgHEM). 15 In beide systemen membraan levensduur aanzienlijk verhoogd (> 10 dagen) . De membraanvorming systemen niet voldoende robuust en kan niet worden opgeslagen of afgeleverd indien vereist deskundigheid vrij die door het gebruik van de lipide bilagen.
De ontwikkeling van een lipide bilaag platform is vooral draaide om het verhogen van de robuustheid en de levensduur van BLMs. Hoewel de levensduur van BLMs is substantially verbeterde recent zijn de toepassingen beperkt door een gebrek transporteerbaarheid en houdbaarheid. Om deze problemen te overwinnen, Jeon et al. Creëerde een houdbare membraan systeem en introduceerde een membraan precursor (MP). 16 Om een MP bouwen, bereidden zij een mengsel van n- decaan en hexadecaan die 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn glycero-3-fosfatidylcholine) van het vriespunt van de lipideoplossing zodat het zou bevriezen bij ~ 14 ° C (beneden kamertemperatuur, typisch boven koelkasttemperatuur) regelen. In dit experiment werd de MP verdeeld over een kleine opening op een polytetrafluorethyleen (PTFE) film en vervolgens in een koelkast bij 4 ° C bevroren. Wanneer de MP tot kamertemperatuur werd gebracht, de MP ontdooid en een lipide bilaag werd automatisch gevormd, waardoor de deskundigheid doorgaans geassocieerd met membraanvorming. Echter, het slagingspercentage van BLM gemaakt van de MP was zo laag als ~ 27%, en het membraan formation keer was inconsistent (30 min tot 24 uur), de praktische toepassingen ervan te beperken.
In deze studie wordt een polydimethylsiloxaan (PDMS) dunne film gebruikt in plaats van een conventionele hydrofobe dunne films (PTFE, polyoxymethyleen, polystyreen) tot (a) controle fabricagetijd en (b) verhogen de slaagkans van BLM formatie eerder door Ryu gemeld et al. 17 Hierin membraanvorming werd vergemakkelijkt door extractie van oplosmiddelen door de poreuze aard van PDMS en de benodigde tijd voor membraanvorming werd succesvol gecontroleerd in deze studie. In dit systeem, omdat de lipideoplossing werd geabsorbeerd in de dunne PDMS film, werd een consistente membraanvorming tijd bereikt. Bovendien werd membraanlevensduur verlengd door langzame absorptie van oplosmiddelen in het PDMS dunne film, een gevolg van de toevoeging van squaleen aan de lipideoplossing. Voerden we optische en elektrische metingen te controleren of membranen gevormd onder toepassing van deze techniek zijn geschikt voor iop kanalen studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Materials
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534———-K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
Referências
- Hanke, W., Schulue, W. . Planar lipid bilayers: methods and applications. , (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
- Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
- Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
- Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
- Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
- Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
- Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
- Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
- Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
- Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
- Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
- Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
- Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
- Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
- Yaws, C. . Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , (1999).
- Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. . The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , (1976).
- Miller, C. . Ion Channel Reconstitution. , (1986).
- Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
- Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
- Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).
