폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막
Summary
우리는 보유, 수송 지질 이중층 형성 시스템을 보여준다. 냉동 막 전구체는 상온 상태로 전환하면 지질 이중층 막을 80 % 성공률 1 시간 내에 형성 될 수있다. 이 시스템은 이온 채널과 관련된 힘드는 과정과 전문 지식을 줄일 수 있습니다.
Abstract
인공 지질 이중층 또는 검은 지질 막 (BLM), 이온 채널 단백질의 상호 작용을 연구뿐만 아니라 바이오 센서 응용 프로그램을위한 강력한 도구입니다. 그러나, 기존의 BLM 형성 기술은 몇 가지 단점을 가지고 있고 그들은 종종 특정 전문 지식과 힘든 과정을 필요로한다. 특히, 기존의 BLMs 낮은 형성 성공률과 일치하지 않는 막 형성 시간을 겪는다. 여기서는, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)을 통상적으로 사용되는 필름 (폴리 테트라 플루오로 에틸렌, 폴리 옥시 메틸렌, 폴리스티렌)로 대체함으로써 조절 시닝 아웃 향상된 BLM 생성율 함께 보유하고 수송 BLM 형성 시스템을 보여준다. 이 실험에서는, 예컨대 PDMS 박막 등의 다공질 구조 중합체가 사용된다. 저점도 통상적으로 사용되는 용매는 대조적으로 또, 스쿠알렌의 사용은 막의 수명을 연장, PDMS에 의해 천천히 용매의 흡수를 통해 제어 시닝 아웃 시간을 허용. 광고에서시 조건은 스쿠알렌과 헥사 데칸의 혼합물을 사용함으로써, 지질 용액의 빙점 무기한 저장되고 용이하게 운반 할 수 있고, 전구체 막을 제작했다 이외에 (~ 16 ° C)를 증가시켰다. 이러한 막 전구체는 <1 시간 BLM의 형성 시간을 단축하고 80 % ~ BLM의 형성 속도를 달성했다. 또한, 그래미시 딘 A의 이온 채널 실험 멤브레인 시스템의 타당성을 입증 하였다.
Introduction
인공 지질 이중층 막 또는 블랙 지질막 (BLM)은 세포막 및 이온 채널의 메카니즘을 해명뿐만 아니라 이온 채널 이온 / 분자간 상호 작용을 이해하기위한 중요한 도구이다. 패치 – 클램프 방법이지만 1-7 종종 세포막 연구 금 표준을 고려하고,이 힘든이고, 이온 채널 측정 숙련 된 작업자를 필요로한다. 8 인위적 재구성 지질 이중층 막 이온 채널 연구 대체 공구로 부상하고 있지만, 9,10-들은 또한 수고와 연관된 프로세스 및 특정 전문 지식. 또한, 막은 기계적 교란에 취약하다. 따라서, 현재까지 도입 지질 이중층 기술은 제한된 실제 적용. (11)
지질 이중층 막, 카스텔 외. (12) 및 IDE와 야나기의 안정성과 수명을 향상시키기 위해서 <sup> 13 하이드로 겔에 의해 지원되는 독립 지질 이중층을 고안 하였다. 그러나 향상된 수명에도 불구하고 (<24 시간), 이중층 견고성이 향상되지 않았다. 전 등. 14 (몇 일까지) 강화 장수의 결과로, 친밀한 하이드로 겔 지질 이중층 연락처와 하이드로 겔 캡슐 막 (HEM)을 고안했다. 더 HEM의 수명을 증가시키기 위해, Malmstadt 및 전 등이. 하이드로 겔 지질이 두 시스템에서의 현장 공유 결합 (cgHEM). (15)를 통해 결합과 하이드로 겔 캡슐 막을 만들어, 막 수명이 크게 증가 (> 십일) . 그러나, 막 형성 시스템은 충분히 강력하지 않았다 및 지질 이중층의 사용에 대한 전문 지식을 해방하는데 필요한 곳에 저장되거나 전달 될 수 없었다.
지질 이중층 플랫폼의 개발은 주로 증가 견고성과 BLMs의 수명 주위에 회귀하고있다. BLMs의 수명은 스와되었지만bstantially 향상된 최근 애플리케이션 인해 수송성 및 보존성의 부족에 한정되었다. 이러한 문제를 극복하기 위하여, 전은 외. 저장 가능한 막 시스템을 생성하고, MP를 구성하는 막 전구체 (MP). (16)를 도입들은 3 % DPhPC (1,2- diphytanoyl- 함유 N- 데칸 헥사 데칸의 혼합물을 제조 SN의 -glycero -3- 포스파티딜콜린)는 그것이 ~ 14 ℃ (실온 이하, 일반적인 냉장고 온도 이상)에서 동결되도록 지질 용액의 빙점을 제어한다. 이 실험에서, MP는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 필름 상에 작은 구멍을 통해 분산시키고,이어서 4 ℃에서 냉장 냉동. 다용도 실온으로 기세 좋게하면 MP 해동 및 지질 이중층 자동 일반적 제막와 연관된 지식을 제거 형성 하였다. 그러나 MP에서 만든 BLM의 성공률은 ~ 27 % 및 막 상자 형성만큼 낮았다N 시간 (30 분 내지 24 시간)이었다 일관성 그 실제 응용을 제한.
이전 류에 의해보고 된 연구에서, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 박막 대신에 (a)의 제어 제조 시간과 (b) BLM 형성의 성공 확률을 높이기 위해, 종래의 소수성 박막 (PTFE, 폴리 옥시 메틸렌, 폴리스티렌)로 사용되는 등. (17) 여기에서는, 제막 인해 PDMS의 다공성 특성의 용매 추출에 의해 촉진되고, 막 형성에 필요한 시간이 성공적으로 연구를 제어 하였다. 지질 용액 PDMS 박막에 흡수되었을 때,이 시스템에서는, 일정한 막 형성 시간이 달성되었다. 또한, 멤브레인의 수명 인해 PDMS 박막 지질 용액 스쿠알렌의 첨가의 결과로 용매를 서서히 흡수 연장 하였다. 우리는이 기술을 사용하여 형성 막 내가 적합한 지 확인하기 위해 광학 및 전기 측정을 실시채널 연구에.
Protocol
Representative Results
Discussion
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Materials
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534———-K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
Referências
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