Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung
Summary
Wir zeigen eine speicherbare, transportierbar Lipid-Doppelschicht Bildungssystem. Eine Lipid-Doppelschicht-Membran kann mit mehr als 80% Erfolgsquote innerhalb von 1 h gebildet werden, wenn eine gefrorene Membran Vorläufer auf Umgebungstemperatur gebracht wird. Dieses System wird mühsamen Prozesse reduzieren und Know-how mit Ionenkanälen verbunden.
Abstract
Eine künstliche Lipiddoppelschicht oder schwarze Lipidmembran (BLM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, Ionenkanäle und Protein-Wechselwirkungen, sowie für Biosensor-Anwendungen für die Untersuchung. Jedoch weisen herkömmliche BLM Bildungstechniken mehrere Nachteile, und sie erfordern häufig spezifische Know-how und eine aufwendige Arbeit. Insbesondere leiden herkömmliche BLMs von niedrigen Bildung Erfolgsraten und inkonsistent Membranbildung Zeit. Hier zeigen wir eine speicherbare und transportierbare BLM Erzeugungssystem mit kontrolliertem Ausdünnungs Zeit und verbesserte BLM Bildungsrate von üblicherweise verwendeten Folien ersetzt (Polytetrafluorethylen, Polyoxymethylen, Polystyrol) zu Polydimethylsiloxan (PDMS). In diesem Experiment wird ein poröser strukturierte Polymer wie PDMS-Dünnfilm verwendet. Zusätzlich, im Gegensatz zu konventionell verwendeten Lösungsmitteln mit niedriger Viskosität, erlaubt die Verwendung von Squalen eine kontrollierte Ausdünnungs Zeit über langsame Lösungsmittelabsorption durch PDMS, Membranlebensdauer verlängert wird. In der Werbunghinaus, indem eine Mischung aus Squalen und Hexadecan verwendet wurde, wurde der Gefrierpunkt der Lipidlösung erhöht (~ 16 ° C), außerdem wurden Membranvorläufern hergestellt, die auf unbestimmte Zeit gelagert werden können und ohne weiteres transportiert werden. Diese Membranvorstufen BLM Bildungszeit von reduzierten <1 h und erreicht eine BLM-Bildungsrate von ~ 80%. Außerdem zeigten Ionenkanal Gramicidin A Versuche mit der Durchführbarkeit des Membransystems.
Introduction
Künstliche Lipiddoppelschichtmembran oder schwarze Lipidmembran (BLM), ist ein wichtiges Werkzeug für die Mechanismen von Zellmembranen und Ionenkanäle, sowie für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Ionenkanälen und Ionen / Moleküle. 1-7 Obwohl der Patch-Clamp – Methode Aufklären künstrekonstruierte Membranen Lipid – Doppelschicht als Alternative Werkzeuge für die Ionenkanal – Studien wird häufig der Goldstandard für die Zellmembran Studien betrachtet, ist es mühsam ist und hoch qualifizierten Operatoren für Ionenkanal – Messungen erfordert. 8 Während entstanden sind, sind 9,10 sie auch mit mühsamen assoziiert Prozesse und spezifisches Know-how. Darüber hinaus sind Membranen auf mechanische Störungen anfällig. Daher Lipid – Doppelschicht – Technologien bisher eingeführt haben nur begrenzte praktische Anwendungen. 11
Um die Robustheit und Langlebigkeit der Lipidmembranen, Costello et al zu verbessern. 12 und Ide und Yanagida <sup> 13 haben eine freistehende Lipid – Doppelschicht von Hydrogelen unterstützt entwickelt. Trotz verbesserte Langlebigkeit jedoch (<24 h) wurde Bilayer Robustheit nicht verbessert. Jeon et al. 14 entwickelt ein Hydrogel verkapselt Membran (HEM) mit intimen Hydrogel-Lipid – Doppelschicht Kontakt, zu einer erhöhten Lebensdauer erreicht wird (bis zu mehrere Tage). Um die Lebensdauer des HEM erhöhen, Malmstadt und Jeon et al. Erstellt ein Hydrogel verkapselt Membran mit Hydrogel-Lipid – Bindung über in-situ kovalente Konjugation (cgHEM). 15 In beiden Systemen Membranlebensdauer deutlich erhöht (> 10 Tage) . Jedoch waren die Membranbildungssysteme nicht ausreichend robust und nicht gespeichert werden könnten oder geliefert, wo der Lipid-Doppelschichten für die Verwendung zu befreien Know-how erforderlich.
Die Entwicklung einer Lipid-Doppelschicht-Plattform hat sich um zunehmende Robustheit und Langlebigkeit der BLMs in erster Linie drehte. Obwohl die Langlebigkeit der BLMs hat su gewesenbstantially kürzlich verbessert wurden ihre Anwendungen wegen mangelnder Transportfähigkeit und Lagerbarkeit begrenzt. Um diese Probleme zu überwinden, Jeon et al. Eine speicherbare Membransystem erzeugt und stellte eine Membran Vorläufers (MP). 16 auf einen MP konstruieren, bereiteten sie ein Gemisch aus n- Decan und Hexadecan , enthaltend 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn – glycero-3-Phosphatidylcholin) zur Steuerung des Gefrierpunktes der Lipidlösung , so dass sie bei ~ 14 ° C (unterhalb der Raumtemperatur, oberhalb typischen Kühlschranktemperatur einfrieren würde). In diesem Experiment wurde die MP verteilt auf eine kleine Öffnung auf eine Polytetrafluorethylen (PTFE) -Folie und anschließend in einem Kühlschrank bei 4 ° C eingefroren. Wenn der MP auf Raumtemperatur gebracht wurde, aufgetaut die MP und eine Lipiddoppelschicht automatisch gebildet wurde, die Expertise Eliminieren typischerweise mit Membranbildung verbunden. Allerdings war die Erfolgsquote der BLM vom MP gemacht so günstig wie ~ 27%, und die Membran Formation war inkonsistent (30 min bis 24 h), die Begrenzung der praktischen Anwendungen.
In dieser Studie wird ein Polydimethylsiloxan (PDMS) Dünnfilm anstelle einer herkömmlichen hydrophoben dünnen Filmen (PTFE, Polyoxymethylen, Polystyrol) bis (a) Steuerherstellungszeit und (b) erhöhen die Erfolgsrate der BLM Bildung verwendet, wie zuvor von Ryu berichtet et al. 17 Hierin wurde die Membranbildung durch Extraktion von Lösungsmitteln erleichtert aufgrund der porösen Natur des PDMS, und die Zeit für die Membranbildung erforderlich war erfolgreich in dieser Studie kontrolliert. In diesem System, da die Lipidlösung in die PDMS-Dünnfilm, eine konsistente Membranbildungszeit absorbiert wurde, wurde erreicht. Außerdem wurde Membranlebensdauer verlängert durch langsame Absorption von Lösungsmitteln in die PDMS-Dünnfilm, ein Ergebnis der Zugabe von Squalen zu der Lipidlösung. Wir führten optischen und elektrischen Messungen zu überprüfen, dass Membranen mit dieser Technik sind für i geeignet gebildetauf den Kanälen Studien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Our BLM formation technique provides a powerful tool for cell membrane and ion channel studies, in contrast to conventional techniques that have limited potential for industrial use. We developed a membrane precursor using a PDMS thin film, and devised a frozen membrane precursor with expedited self-assembly.
As opposed to conventional membrane formation methods with hydrophobic films, where membrane formation only occurs via surface interactions between the film and the lipid solution,20…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) and National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) from the National Research Foundation of Korea. This work was also partially supported by the Inha University Research Grant.
Materials
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534———-K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
Referências
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