Formação Automated Lipid bicamada da membrana Usando um polidimetilsiloxano Thin Film

Resumo

Nós demonstramos um sistema armazenável e transportável de lípidos em bicamada. Uma membrana de bicamada de lípido pode ser formado dentro de 1 hora com uma taxa de sucesso superior a 80% quando um precursor de membrana congelada é levada até à temperatura ambiente. Este sistema irá reduzir os processos laboriosos e conhecimentos associados com canais de íons.

Resumo

Uma bicamada lipídica artificial, ou membrana lipídica preto (BLM), é uma ferramenta poderosa para estudar canais iônicos e interações proteína, bem como para aplicações de biossensores. No entanto, técnicas de formação de BLM convencionais têm várias desvantagens e que muitas vezes exigem conhecimentos específicos e processos laboriosos. Em particular, MBL convencionais sofrem de taxas de sucesso de formação baixos e tempo de formação da membrana inconsistente. Aqui, nós demonstramos um sistema de formação de BLM armazenável e transportável com o tempo de desbaste-out controlado e maior taxa de formação de BLM, substituindo filmes tradicionais (politetrafluoretileno, polioximetileno, poliestireno) de polidimetilsiloxano (PDMS). Nesta experiência, um polímero poroso estruturado tal como película fina de PDMS é usado. Além disso, ao contrário de solventes convencionalmente utilizados com baixa viscosidade, o uso de esqualeno permitido um tempo de desbaste de saída controlada por via de absorção lenta solvente por PDMS, prolongando tempo de vida da membrana. Em anúnciodição, usando uma mistura de esqualeno e hexadecano, o ponto de congelação da solução de lípido foi aumentada (~ 16 ° C), além disso, os precursores de membrana foram produzidas, que pode ser armazenado indefinidamente e facilmente transportado. Estes precursores de membrana ter reduzido BLM tempo de formação de <1 h e alcançou uma taxa de formação de BLM de ~ 80%. Além disso, as experiências de canal iónico com gramicidina Um demonstraram a viabilidade do sistema de membrana.

Introdução

Artificial membrana bicamada lipídica, ou membrana lipídica preto (BLM), é uma ferramenta importante para a elucidação mecanismos de membranas celulares e canais iônicos, bem como para compreender as interacções entre canais de íons e íons / moléculas ^1-7 Embora o método de patch-clamp. é muitas vezes considerado o padrão ouro para estudos da membrana celular, é trabalhoso e requer operadores altamente qualificados para medições de canais de íons. ⁸ enquanto membranas bicamada lipídica artificialmente reconstituídos surgiram como ferramentas alternativas para estudos de canais iônicos, ^9,10 eles também estão associados com laboriosa p....

Protocolo

1. Preparação de Soluções

1. Preparação de solução tampão:
   1. Para formular uma solução tampão, dissolve-se 1 M de KCl (cloreto de potássio), Tris-HCl 10 (Tris-hidrocloreto), e 1 mM de EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) em água destilada e ajustar o pH a 8,0.
   2. Filtrar a solução através de um filtro de 0,20? M. Para esterilizar, autoclave a solução a 121 ° C durante 15 min.
2. Preparação da solução de lípidos para a pré-pintura:
   1. Para formular a solução de lípido para pré-pintura, dissolver 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl--sn-glicero-3-fosfatidilcolina) lípido (w: v) numa mistura de 2: 8 e n -decano hexa....

Resultados

Optimização das MPE Solução Composição
Diferentes composições de lípidos e solventes foram testados com sucesso para reconstituir membranas de bicamada lipídica da MPES. O sistema de MP com uma mistura de n- decano e hexadecano contendo 3% DPhPC ¹⁴ exibiram uma baixa taxa de sucesso de formação de membrana (~ 27%). Além disso, como o filme de PDMS extraiu-se continuamente solução de lípido, que era necessária para optimizar a composição de solv.......

Discussão

Nossa técnica de formação de BLM fornece uma ferramenta poderosa para estudos de membranas celulares e canais iônicos, em contraste com as técnicas convencionais que têm potencial limitado para uso industrial. Desenvolvemos um precursor de membrana usando um filme fino PDMS e criamos um precursor de membrana congelada com automontagem acelerada.

Ao contrário dos métodos convencionais de formação de membranas com filmes hidrofóbicos, onde a formação de membranas ocorre apenas por meio de intera.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P9333	Para solução tampão
Tris-cloridrato	Sigma-Aldrich	1185-53-1	Para solução tampão
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma-Aldrich	60-00-4	Para solução tampão
n-decano	Sigma-Aldrich	44074-U	Para solução
lipídicaHexadecano	Sigma-Aldrich	544-76-3	Para solução lipídica
Esqualeno	Sigma-Aldrich	S3626	Para solução lipídica
Gramicidina A	Sigma-Aldrich	11029-61-1	Proteína de membrana
1,2-difitanoil-sn< / em>-glicero-3-fosfocolina	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356	Para formação de membrae
Sylgard 184a e 184b elastromer kit	Dow Corning Asia		Para produzir filme fino PDMS
0,2 μ Filtro m	Satorius stedim	16534----------K	Para filtrar a solução tampão
Rotator	FinePCR	AG	Para dissolver os lipídios homogeneamente
Autoclave	Biofree	BF-60AC	Para esterilizar a solução tampão
Revestidor giratório	Shinu Mst	SP-60P	Para espalhar o pré-polímero PDMS
Dessecador de vácuo	Welch	2042-22	Para remover bolhas de ar em pré-polímero PDMS
500 μ m  punção	Harris Uni-Core	0.5	Para criar uma abertura na máquina CNC de filme fino PDMS
	SME trading	SME 2518	Para fabricar câmara de formação de membrana
Iluminador de fibra óptica halógena	Motic	MLC-150C	Para iluminar a abertura do filme fino PDMS para observação óptica
Microscópio digital	Digital blue	QX-5	Para observar opticamente a membrana de bicamada lipídica formação
Eletrodo	Sistemas AM		Para observar eletricamente a formação da membrana
Amplificador de microeletrodo (amplificador Axopatch)	Axon Instruments	Amplificador Axopatch 200B	Para medir a capacitância da membrana (descrito como amplificador de microeletrodo no manuscrito)