מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded
Summary
This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.
Abstract
Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.
Introduction
החלבונים הם מקרומולקולות הנפוצים ביותר בתאים, והם ממלאים תפקיד חיוני בכל התהליכים הביולוגיים כמעט. הפעילות הביולוגית של רוב החלבונים דורש המתקפלים שלהם לתוך, ושמירה, המבנים תלת מימדי הילידים. חלבונים עם תצורות סוטות לא רק לאבד פונקציות הרגילות שלהם, אלא גם לעתים קרובות מהווים מיני oligomeric מסיסים או אגרגטים הפוגעים פונקציות של חלבונים אחרים רעילים 1,2 תאים. כדי לנטרל misfolding חלבון, תאים להעסיק שני מלווים מולקולריים, אשר מסייעים פוליפפטידים פרשו או חלקית מקופל להגיע קונפורמציה האם שלהם, מסלולים שפלים, המבטלים חלבוני misfolded 3. בהתחשב במורכבות והטבע סטוכסטיים של תהליך הקיפול, misfolding חלבון הוא בלתי נמנע, זה לא יכול להיות הפוך במקרה של מוטציות, שגיאות biosynthetic, ופוסט translational נזקים 1. לפיכך, התאים בסופו של דבר להסתמך על degradatמסלולי יון כדי לשמור על איכות החלבון שלהם.
חשיבותה של בקרת איכות חלבון הסלולר (PQC) מערכות מודגשת על ידי שכיחות המחלות misfolding-חלבון, כולל סרטן, סוכרת, הפרעות ניווניות רבות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, מחלת הנטינגטון (HD), ו ataxias spinocerebellar (SCA) 4,5. לדוגמא, מוטציות p53 המדכאים גידולים הוא הנגע היחיד ביותר הגנטי לעתים קרובות בגידולים, הקשורים ~ 50-70% מכלל המקרה 6. חלק ניכר של מוטציות p53 הם מוטציות missense המשנים את הקונפורמציה של p53, המוביל להיווצרות של אגרגטים 7. יתר על כן, חלבונים עם מתיחות polyQ המתרחבות גנטית פתולוגית הקשורה HD ו SCA. מחלות פרוגרסיבי ולעתים אף קטלניות אלה מניפסט כאשר אורכו של קטע polyQ בחלבונים הפגועים עולה על thres מסויםלהחזיק, ואז הוא הופך יותר ויותר קשה ככל שהאורך של מתיחת polyQ מאריך 8.
גישה אטרקטיבית לטיפול במחלות אלה היא לחזק טיפולי מערכות PQC הסלולר, במיוחד את המסלולים השפלים. עם זאת, את המסלולים המעורבים פירוק של חלבונים פגומים, במיוחד אלה בתאי יונקים, להישאר ממעטים להבין. למרות שזה הוכר כי הפרוטאזום יש חשיבות קריטית עבור הפירוק של חלבוני misfolded, סוגיה חיונית נשארה בלתי מוגדרת: איך misfolded חלבונים מוכרים במיוחד וממוקד שפלה. יתר על כן, למרות מערכות PQC זוהו תאים סלולריים כולל הציטופלסמה, הרטיקולום endoplasmic, ואת מיטוכונדריון, מערכות PQC בגרעין עדיין אינן ברורות 2.
מחקרים שנעשו לאחרונה על ידי המעבדה שלנו זיהו מערכת שתופש מדרדרת מגוון של חלבונים misfolded בגרעיןשל יונקים תאים 9. מערכת זו מורכבת של חלבון פרומיילוציטית (PML), חלבון גרעיני חבר מוטיב המכילים המשולשת (TRIM) המשפחה חלבון, RNF4, תחום-RING המכיל חלבון. PML, וכמה חלבונים TRIM אחרים, להחזיק SUMO (המשתנה 'היוביקוויטין דמוי קטן) פעילות האנזים E3, אשר הופך לפשוט את הספציפיות והיעילות של חלבון SUMOylation 10. RNF4 שייך לקבוצה קטנה של ליגאזות היוביקוויטין SUMO במיקוד (STUbL), אשר מכילים מוטיבים סומו אינטראקציה אחד או יותר (SIMS) בנוסף תחום RING שמקנה להם את פעילות האנזים היוביקוויטין 11. מצאנו כי PML במיוחד מזהה חלבוני misfolded דרך אתרי הכרת מצע דיסקרטיים שיכול להבחין ייחודיות על חלבוני misfolded. עם מחייב, תגי PML misfolded חלבונים עם פולי-שרשראות של SUMO2 / 3, שני חלבונים SUMO יונקים כמעט זהה כי יכול להיווצר פולי-שרשראות בשל קיומו של אתר SUMOylation פנימי. Sחלבונים misfolded UMOylated מוכרים ולאחר מכן על ידי RNF4, אשר מוביל לזילות ubiquitination ו proteasomal שלהם. בנוסף, אנו הראו כי מערכת PML-RNF4 חשוב להגנה מפני ניוון מוחיים, כמו מחסור PML מחריף הפגמים התנהגותיות נוירו של במודל של עכברים של SCA סוג 1 (SCA1) 9.
כדי להבחין פירוק חלבונים מן המנגנונים תאיים אחרים שעשויים לווסת את רמות חלבון, ושיעור עזיבת חלבון נמדד 9. בין השיטות הנפוצות ביותר כדי לקבוע מחזור חלבון הם מרדף דופק cycloheximide (chx) מרדף. שתי שיטות אלו בודקות לאורך זמן, בהתאמה, את החלבונים שכותרתו רדיואיזוטופיים של ריבית בתאי תרגום-בקיא וחלבונים קיימים מראש כולל של ריבית בתאים-עכבות תרגום. עם זאת, אתגר גדול ללימוד חלבונים פתוגניים misfolding נוטה הוא כי זמן מחצית החיים של חלבונים אלה יכולים להיות מאוד long. לדוגמה, Ataxin-1, Ataxin-7, huntingtin, α-synuclein, ו TDP-43 כל זמן מחצית חיים של יותר מ 12 עד 24 שעות 9,12-16. שיעורי התחלופה האיטיים של החלבונים האלה להוציא את השימוש בניתוח מרדף chx כיוון שתא מחסה חלבונים אלה לא יכול לשרוד עיכוב תרגום ממושך, במיוחד משום שחלבוני misfolded עצמם יכולים להיות רעילים לתאים. הניתוח הדופק מרדף עם תיוג איזוטופי עשוי גם להיות מאתגר עבור חלבונים כי הם מאוד צבירה נוטה. רוב מבחני הדופק מרדף להסתמך על immunoprecipitation להפריד את החלבון של עניין מכל חלבונים אחרים אשר גם מסומנים רדיואקטיבית. הליך זה בדרך כלל כולל נהלי immunoprecipitation לשטוף ממושך, שבמהלכו SDS-מסיסי אגרגטים יכולים ליצור, מה שהופך את הניתוח עם SDS-PAGE אלקטרופורזה מדויק.
הנה פרוטוקול לנתח חלבוני misfolded גרעין עם תחלופה איטית מתוארת 9. צורה פתוגניים של Ataxin-1 (Atxn1) שמכיל מתיחה של 82 glutamines (Atxn1 82Q) משמש למטרה זו 8. כאשר לידי ביטוי בתאים, חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (GFP) היתוך של צורות Atxn1 82Q תכלילים גלוי מיקרוסקופית בגרעין (איור 1 א). ניתוח מרדף דופק מגלה כי זמן מחצית החיים של Ataxn1 82Q הוא מעל 18 שעות 9. Atxn1 82Q מורכב מינים עם תצורות misfolded של מאפיינים שונים, כמו גם מינים עם קונפורמציה הילידים. סביר להניח כי מינים אלה מפורקים בשיעורים שונים, ובכך יש לנתח בנפרד. Lysates מ 82Q-GFP להביע תאי Atxn1 הם מופרדים לתוך NP-40-מסיס (מסיס או NS, מייצג חלבוני ילידים סביר או חלבוני monomeric misfolded / oligomeric) ו- NP-40-מסיסים (NI, מצטבר / misfolded) חלקים. השלב האחרון ניתן לחלוקה נוספת לתוך SDS-מסיסים (SS; אגרגטים סדר סביר) או SDS-עמיד (SR; סיבי עמילואיד סבירשברים) (איור 1 ב). שברי NS האס יכולים להיות מנותחים על ידי SDS-PAGE ואחריו מערבי סופג, ואילו חלק SR יכול להיות מזוהה על ידי מבחני פיגור המסנן ואחריו immunoblotting. מרדף chx בשילוב עם שיטת חלוקת חומרי הניקוי, וגילה כי זמן מחצית החיים של SS Atxn1 82Q הוא הרבה יותר קצר מזה של NS Atxn1 82Q והמוחלט Atxn1 82Q (איור 2 א), המציין כי חלק SS ניתן להכיר בקלות והשפיל בתאים 9. לכן, שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי ללמוד את הדינמיקה של חלבונים misfolded ולהשוות דפוס השפלה שלהם.
כמו כן, אנו מתארים שיטה כי הוא מתאים להקרנת תפוקה גבוהה לזיהוי מולקולות או תרכובות קטנות שיכול להשפיע על הפירוק של חלבוני misfolded. שיטה זו מבוססת על מוטצית ערער conformationally של בלוציפראז גחלילית (LucDM) 17, מצע מלווה מודל. יש לנו פתילד LucDM לאות לוקליזציה גרעיני (NLS), שנועד לבחון את מערכות PQC בתא הסלולרי הזה, ו- GFP (NLS-LucDM-GFP) לנוחות זיהוי. צורות NLS-LucDM-GFP אגרגטים גרעיניים גלויים מיקרוסקופי אצל אחוז קטן של תאים (איור 3 א). בדומה Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-אבל לא עמיתו wild-type שלה NLS-LucWT-GFP-הוא שונה על ידי SUMO2 / 3 ומוסדר על ידי מסלול PML-RNF4 9. NLS-LucDM-GFP מהווה גם SS ומינים SR, למרות הכמויות היחסיות של SS ומינים SR הן מינימליות לעומת NS, באמצעות התנאים המתוארים בפרוטוקול 3 להלן. כדי לפשט את assay, אנחנו רק לנתח SDS LucDM המסיס (כולל הוא את NS ושברי SS) על ידי SDS-PAGE ומערב כתם. חשוב לציין, assay מרדף chx הראה כי זמן מחצית החיים של SDS-מסיס NLS-LucDM-GFP הוא הרבה יותר קצר מזה של עמיתו wild-type שלה (איור 3), דבר המצביע על כך LucDM הוא מצע ספציפי עבור מערכת שתופש מדרדרתחלבוני misfolded.
השפלתו של LucDM-GFP גורמת לירידה משמעותית אותות קרינה כוללים. לכן, פיתחנו גם פרוטוקול זיהוי בזמן אמת של microplate הסלולר LucDM-GFP באמצעות assay הקרינה מבוססי. רבי מסך תפוקה גבוהה (HTS) מערכות מפותחות עבור תרופות או גני שינוי אגרגטים הסלולר ואת הכדאיות הסלולר נגרם על ידי חלבונים סוטים 18-20. עם זאת, מעט מאוד HTSs נועד במיוחד למיקוד שפל בתאי יונקים. פרוטוקול זה משמש כמערכת חזקה לניתוח בקנה מידה הגדולה המהירה של התופעות של ביטוי חלבון, מציאה, וטיפול תרופתי על פירוק חלבונים הסלולר misfolded. שימוש בתאי הלה כמו למשל, נתאר את הפרוטוקולים לניתוח שני חלבונים misfolded אלה. המבחנים יכולים להיות מיושם גם שורות תאים אחרות, אם כי תנאי transfection ומהלכים זמן ייתכן שיהיו צורך מותאם שורות תאים בודדות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מנגנונים מווסתים הפירוק של חלבוני misfolded חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס של חלבונים תאיים, והם ככל הנראה מייצגים מטרות תרופה יקרות לטיפול בהפרעות ניווניות ומחלות misfolding-חלבון אחרות. כאן, מבחני הבוחנים את הפירוק של החלבונים misfolded מתוארים, באמצעות חלבון Atxn1 פתוגניים (Atxn1 82Q) …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
Referências
- Dobson, C. M. Protein folding and misfolding. Nature. 426, 884-890 (2003).
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Trinucleotide repeat disorders. Annu Rev Neurosci. 30, 575-621 (2007).
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. . Handbook of Biological Statistics. 3, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
