細胞におけるミスフォールドタンパク質の分解のためのアッセイ
Summary
This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.
Abstract
Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.
Introduction
タンパク質は、細胞中で最も豊富な巨大分子であり、それらは事実上すべての生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。ほとんどのタンパク質の生物学的活性は、それらの中に折り畳み、そして、天然の三次元構造を維持することが必要です。異常なコンフォメーションを有するタンパク質は、それらの正常な機能を失うだけでなく、頻繁に他のタンパク質の機能を損ない、細胞1,2に対して毒性である可溶性オリゴマー種または凝集体を形成しません。タンパク質の誤った折り畳みに対抗するために、細胞は、ミスフォールドタンパク質3を除去分子鎖両その天然のコンフォメーションに到達するために折り畳まれていないまたは部分的に折り畳まれたポリペプチドを助けるシャペロン、および分解経路を利用します。複雑さと折り処理の確率的な性質を考えると、タンパク質ミスフォールディングは不可避であり、突然変異、生合成誤差、および翻訳後ダメージ1の場合には逆にしなくてもよいです。したがって、細胞は、最終的degradatに依存しますイオン経路は、それらのタンパク質の品質を維持します。
細胞タンパク質の品質管理（PQC）システムの重要性は、癌、糖尿病、アルツハイマー病などの多くの神経変性疾患、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病（HD）を含む、タンパク質の誤った折りたたみに起因する疾患の有病率によって強調され、そして脊髄小脳失調（SCA）4,5。例えば、腫瘍抑制因子p53の変異が全てのケース6の〜百分の50から70までに関連した腫瘍における単一の最も頻繁に遺伝的損傷、です。 p53変異のかなりの部分が凝集体7の形成をもたらすp53のコンホメーションを変化させるミスセンス変異です。また、拡張したポリQストレッチを有するタンパク質は、遺伝的および病理学的にHDとSCAに関連付けられています。影響を受けたタンパク質におけるポリQストレッチの長さが一定THRESを超えるマニフェストこれらの進歩的な、しばしば致命的な疾患ホールド、およびポリQストレッチの長さが8を延長するよう、ますます深刻になります。
これらの疾患を治療するための魅力的なアプローチは、治療的にセルラPQCシステム、特に分解経路を強化することです。しかし、欠陥タンパク質の分解に関与する経路は、特に、哺乳動物細胞中で、十分に理解残ります。プロテアソームは、ミスフォールドタンパク質の分解のために非常に重要であることが認識されているが、重要な問題は、未定義のまま：特異的に認識し、分解の標的とされている方法をミスフォールドタンパク質。 PQCシステムは、細胞質、小胞体およびミトコンドリアなどの細胞区画において同定されているが、さらに、核内PQCシステムは2不明です。
私たちの研究室による最近の研究では、核内のミスフォールドタンパク質の多様性を認識し、分解するシステムを同定しました9哺乳動物細胞。このシステムは、前骨髄球性タンパク質（PML）、核タンパク質と三者モチーフ含有（TRIM）タンパク質ファミリーのメンバー、及びRNF4、タンパク質を含有するRINGドメインから構成されています。 PML、およびいくつかの他のTRIMタンパク質は、タンパク質のSUMO化10の特異性および効率を促進SUMO（小さ なユビキチン様修飾因子）E3リガーゼ活性を有します。 RNF4は彼らにユビキチンリガーゼ活性11が得られるRINGドメインに加えて、1つまたは複数の大相撲相互作用モチーフ（SIMS）を含有するSUMO標的ユビキチンリガーゼ（STUbL）、の小さなグループに属しています。我々は、PMLは、具体的にミスフォールドタンパク質に明確な特徴を識別することができる個別の基質認識部位を介して、ミスフォールドタンパク質を認識することを発見しました。結合すると、PMLタグは内部SUMO化部位の存在に起因するポリ鎖を形成することができるSUMO2 / 3のポリ鎖、2ほぼ同一の哺乳動物のSUMOタンパク質を有するタンパク質をミスフォールド。 SUMOylatedミスフォールドタンパク質は、その後、それらのユビキチン化およびプロテアソーム分解につながるRNF4、によって認識されています。我々はさらにPMLの欠乏は、SCAタイプ1（SCA1）9のマウスモデルの行動と神経病理学的欠陥を悪化させるとしてPML-RNF4システムは、神経変性に対する保護のために重要であることを実証しました。
タンパク質レベルを調節することができる他の細胞機構からのタンパク質分解を区別するために、タンパク質の代謝回転率は9を測定しました。タンパク質の代謝回転を決定するために最も頻繁に使用される方法の中にパルス追跡およびシクロヘキシミド（CHX）チェイスです。これらの2つの方法は、それぞれ、時間をかけて翻訳熟練細胞および翻訳を阻害し、細胞中の目的の合計既存のタンパク質への関心の放射性同位体標識タンパク質を調べます。しかし、病原性とミスフォールディングが発生しやすいタンパク質を研究するための主要な課題は、これらのタンパク質の半減期は非常に見よすることができることですngの。例えば、アタキシン1、アタキシン7、ハンチンチン、αシヌクレイン、およびTDP-43のすべては、以上の12〜24時間9,12-16の半減期を有します。これらのタンパク質を保有する細胞は特にそれ自体が細胞に対して非常に毒性であり得るミスフォールドタンパク質ので、長時間の翻訳阻害に耐えられない可能性があるため、これらのタンパク質の遅い回転率は、CHXチェイス分析の使用を排除します。同位体標識とパルスチェイス分析も非常に凝集しやすいであるタンパク質のために挑戦することがあります。ほとんどのパルスチェイスアッセイはまた、放射性標識されているすべての他のタンパク質から目的のタンパク質を分離するために、免疫沈降に依存しています。この手順は、通常、不正確なSDS-PAGE電気泳動で解析を行う、SDS不溶性凝集体を形成することができる時に長い免疫沈降し、洗浄手順を含みます。
ここでは、低速回転率と核ミスフォールドタンパク質を分析するためのプロトコルが記載されている9。グルタミン82（Atxn1 82Q）のストレッチが含まれていアタキシン1（Atxn1）の病原型は、この目的の8のために使用されます。細胞内で発現された場合、核（ 図1A）でAtxn1 82Qの微視的形態可視介在物の増強された緑色蛍光タンパク質（GFP）融合。パルスチェイス分析はAtaxn1 82Qの半減期が18時間9以上であることが明らかになりました。 Atxn1 82Qは、ネイティブコンホメーションのミスフォールド特性の異なるコンフォメーションと同様に、種と種で構成されています。これらの種が異なる速度で分解される可能性があり、従って、別々に分析されるべきです。 Atxn1 82Q-GFP発現細胞からの溶解物は、NP-40水溶性（溶解性またはNS、おそらく天然のタンパク質またはミスフォールドオリゴマー/モノマータンパク質を表す）とNP-40不溶性（NI、集約/ミスフォールド）の部分に分画されます。 （;おそらく不規則凝集SS）又は（SDS耐性SR;後者は、さらにSDS可溶性に分割することができる可能性がアミロイド線維を）画分（ 図1B）。 SR画分をイムノ続くフィルター遅延アッセイにより検出することができるのに対し、NS及びSSフラクションを、ウェスタンブロットに続くSDS-PAGEによって分析することができます。 CHXチェイスは、界面活性剤分画法と組み合わせて、およびSS Atxn1 82Qの半減期は、SS画分が容易に認識し、分解され得ることを示し、NS Atxn1 82Qおよび総Atxn1 82Q（ 図2A）よりもはるかに短いことが発見されています細胞9インチしたがって、この方法は、ミスフォールドタンパク質のダイナミクスを研究するために、それらの分解パターンを比較するための強力なツールを提供します。
我々はまた、ミスフォールドタンパク質の分解を調節することができる巨大分子または小化合物を同定するためのハイスループットスクリーニングに適している方法を説明します。この方法は、ホタルルシフェラーゼ（LucDM）17、モデルシャペロン基板の立体構造的に不安定化変異体に基づいています。私たちは、ヒューズを持っています検出の便宜のためにdは、この細胞区画にPQCシステムをプローブする核局在化シグナル（NLS）にLucDM、およびGFP（NLS-LucDM-GFP）。細胞のわずかな割合でNLS-LucDM-GFPフォーム顕微鏡で見える核の凝集体（ 図3A）。 Atxn1 82Q、NLS-LucDM-GFP-ではなく、その野生型対応NLS-LucWT-GFP-さSUMO2 / 3によって修正されたとPML-RNF4経路9により規制と同様に。 SSおよびSR種の相対量は、プロトコル以下3に記載の条件を使用して、NSに比べてごくわずかですが、NLS-LucDM-GFPはまた、SSおよびSR種を形成しています。アッセイを簡素化するために、我々は唯一のSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって（NSとSS画分の両方を含む）SDS可溶性LucDMを分析します。重要なことには、CHXチェイスアッセイは、SDS可溶性NLS-LucDM-GFPの半減期はLucDMを認識し、劣化システムに特異的な基質であることを示唆し、その野生型対応物（ 図3B）よりもはるかに短いことが示されましたミスフォールドタンパク質。
LucDM-GFPの分解は、全体的な蛍光シグナルの有意な低下を引き起こします。したがって、我々はまた、マイクロプレート蛍光ベースのアッセイを用いて細胞LucDM-GFPのリアルタイム検出のためのプロトコルを開発しました。多くのハイスループットスクリーニング（HTS）システムは、異常なタンパク質18-20によって引き起こされる細胞凝集体および細胞生存率を変更する薬剤や遺伝子のために開発されています。しかし、非常に少数のHTSsは、具体的には、哺乳動物細胞中での分解を標的とするために設計されています。このプロトコルは、細胞のミスフォールドタンパク質の分解のタンパク質の発現、ノックダウン、および薬物治療の効果の迅速かつ大規模な分析のために強固なシステムとして機能します。我々は、これら2つのミスフォールドタンパク質の分析のためのプロトコルを説明する以下の実施例として、HeLa細胞を用いました。トランスフェクション条件および時間経過は、個々の細胞株について最適化される必要があるかもしれないが、アッセイはまた、他の細胞株にも適用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ミスフォールドタンパク質の分解を調節するメカニズムは、細胞タンパク質の恒常性を維持するために必須であり、それらはおそらく神経変性疾患および他のタンパク質の誤った折りたたみに起因する疾患を治療するための価値ある薬物標的を表します。ここでは、ミスフォールドタンパク質の分解を調べるアッセイは、例として、病原Atxn1タンパク質（Atxn1 82Q）および核局在化ルシフェラ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
Referências
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