Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller
Summary
This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.
Abstract
Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.
Introduction
Proteinler hücrelerde en fazla yer alan makromoleküllerdir ve bunlar hemen hemen tüm biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. çoğu proteinin biyolojik aktivitesi içine katlama gerektirmemekte ve doğal üç boyutlu yapılara muhafaza. Anormal yerleşimleriyle Proteinler sadece normal işlevlerini kaybeder, ama aynı zamanda sık sık diğer proteinlerin fonksiyonlarını bozar ve hücrelerin 1,2 toksik olan çözünebilir oligomerik türler veya agrega oluşturmaz. Protein yanlış katlanmasına karşı için hücreler yanlış katlanmış proteinleri 3 ortadan hem moleküler, kendi doğal şekillerinde ulaşmak için katlanmamış veya kısmen katlanmış polipeptidleri yardımcı şaperonlar ve degradasyon yollarını, kullanır. Karmaşıklığı ve katlama sürecinin stokastik doğası göz önüne alındığında, protein yanlış katlanması kaçınılmaz olduğunu ve mutasyonlar, biyosentetik hatalar, ve post-translasyonel zararların 1 durumunda ters olmayabilir. Bu nedenle, hücreleri sonuçta degradat itimatiyon yollar protein kalitesini korumak için.
hücresel protein kalite kontrol önemi (PQC) sistemleri, kanser, diyabet ve Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz, Huntington hastalığı (HD) gibi birçok nörodejeneratif rahatsızlıklar dahil olmak üzere protein yanlış katlayan hastalıklarının sıklığı altını, ve spinoserebellar ataksi (SCA) 4,5. Örneğin, tümör baskılayıcı p53'ün mutasyonlar her durumda 6% 50-70 ~ ilişkili tümörlerde, tek en sık genetik lezyondur. P53 mutasyonlarının önemli bir bölümüyle agrega 7 oluşumuna yol p53 yapısını değiştirmek yanlış anlamlı mutasyonlar vardır. Ayrıca, genişletilmiş polyQ uzanıyor sahip proteinler genetik ve patolojik HD ve SCA ile ilişkilidir. Etkilenen proteinlerde polyQ streç uzunluğu belli bir eşik dönemi aştığında bu ilerici ve genellikle ölümcül hastalıklar tezahürtutun ve polyQ streç uzunluğu 8 uzatır olarak giderek daha şiddetli hale gelir.
Bu hastalıkların tedavisi için çekici bir yaklaşım, terapötik olarak hücresel PQC sistemleri, özellikle de degradasyon yollarını yastığı sağlamaktır. Ancak bozuk proteinlerin memeli hücrelerinde özellikle parçalanması ile ilgili yollar, yeterince anlaşılamamıştır. o proteazom katlanan proteinlerin bozulması için kritik öneme olduğu kabul edilmiştir rağmen, hayati bir mesele tanımlanmamış kalır: Özellikle tanınan ve yıkım için hedeflenmiş nasıl katlanan proteinler. PQC sistemleri sitoplazma, endoplazmik retikulum ve mitokondri gibi hücresel bölümlerinde tespit edilmiştir, ancak ayrıca, çekirdekte PQC sistemleri 2 tam olarak bilinmemektedir.
laboratuarımızda tarafından yapılan son çalışmalar çekirdekte yanlış katlanmış proteinler çeşitli tanır ve bozan bir sistem belirledikmemeli hücre, 9. Bu sistem, promiyelositik protein (PML), nükleer protein ve üçlü motif ihtiva eden (TRIM) protein ailesinin bir üyesi ve RNF4, protein ihtiva eden bir halka-etki oluşur. PML ve çeşitli diğer kesme proteinler, protein SUMOylation 10 özgünlüğünü ve verimliliğini kolaylaştırır SUMO (küçük ubikitin benzeri modifiye edici) ile E3 ligaz aktivitesi, sahiptirler. RNF4 onlara ubikuitin ligaz aktivitesinin 11 tanıyor HALKA etki ek olarak bir veya daha fazla sumo-etkileşim motifleri (SIMS) ihtiva SUMO hedefli ubikitin ligazlara (Stubl), küçük bir grup aittir. Biz PML özellikle yanlış katlanmış proteinlerle ilgili farklı özellikleri ayırt edebilir ayrık alt tabaka tanıma siteleri aracılığıyla katlanan proteinleri tanıdığı bulundu. bağlanma üzerine, PML etiketler dahili SUMOylation sitesinin varlığı nedeniyle poli-zincir oluşturabilirler SUMO2 / 3 poli-zincir, iki hemen hemen aynı memeli SUMO proteinlerle proteinleri yanlış katlanmış. SUMOylated katlanan proteinler daha sonra ubikuitinasyon ve proteozomal bozulmasına yol açar RNF4, tarafından tanınır. Biz daha PML yetersizlik SCA türü bir fare modelinde 1 (SCA1) 9 davranışsal ve nöropatolojik kusurları şiddetlendirir olarak PML-RNF4 sistemi, nörodejenerasyon karşı koruma için önemli olduğunu göstermiştir.
Protein düzeyleri düzenleyen diğer hücresel mekanizmaları protein parçalanmasını ayırt etmek için, protein ciro oranları 9 ölçüldü. Protein ciro belirlemek için en sık kullanılan yöntemler arasında nabız kovalamaca ve sikloheksimid (CHX) kovalamaca vardır. Bu iki yöntem zamanla incelemek, sırasıyla, çeviri-yetkin hücreleri ve çeviri-inhibe hücrelerde ilgi toplam önceden var olan proteinlerin ilgi radyoizotop işaretli proteinler. Ancak, patojen ve yanlış katlanması eğilimli proteinleri eğitim için önemli bir sorun bu proteinlerin yarı ömrü son derece lo olabilir olduğunung. Örneğin, ataksin-1, ataksin-7, Huntingtin, α-sinüklein ve TDP-43 24 saat 9,12-16 fazla 12 yarılanma ömürleri. bu proteinleri barındıran hücreler, uzun süreli çeviri inhibisyonunu hayatta olmayabilir, özellikle yanlış katlanmış proteinlerle çünkü kendileri hücreler için oldukça zehirli olabilir çünkü bu proteinlerin yavaş devir hızları CHX kovalamaca analizi kullanımını engellemektedir. izotopik etiketleme ile darbe kovalamaca analizi aynı zamanda son derece toplama eğilimli olan proteinler için zor olabilir. En çok darbe kovalayıcı deneyler, aynı zamanda, radyoaktif etiketli tüm diğer proteinlerden ilgili proteini ayırmak için immüno kullanır. Bu işlem, normal olarak, yanlış SDS-PAGE elektroforezi ile analiz yapmak SDS çözülmeyen agrega oluşturabilen sırasında uzun immünopresipitasyon ve yıkama işlemleri içerir.
Yavaş devir hızı 9 açıklanan burada bir protokol nükleer katlanan proteinleri analiz etmek. 82 glutaminler (Atxn1 82Q) bir kısım içeren ataksin-1 (Atxn1) patojenik bir şekilde, bu amaçla 8 kullanılır. Hücre içinde sentezlendiğinde, çekirdeği (Şekil 1A) Atxn1 82Q mikroskopik formları görebilir inklüzyonlar gelişmiş yeşil floresan proteini (GFP), füzyon. Darbe kovalamaca analizi Ataxn1 82Q yarı ömrü boyunca 18 saat 9 olduğunu ortaya koymaktadır. Atxn1 82Q doğal yapısındaki ile yanlış katlanmış farklı özelliklere konformasyonları, hem de türler ile türlerden oluşmaktadır. Tür farklı oranlarda degrade olması muhtemeldir ve bu nedenle ayrı ayrı analiz edilmesi gerekmektedir. gelen lizatlar Atxn1 82Q-GFP ifade eden hücreler, NP-40 çözülebilir (çözünebilir veya NS, büyük olasılıkla doğal proteinleri veya yanlış katlanmış oligomerik / monomer proteinleri temsil eder) ve NP-40 çözünmeyen (Nı, toplu / yanlış katlanmış) kısımlar halinde bölünür. (Büyük ihtimalle düzensiz agregalar SS) ya da (SDS-dirençli SR, ikincisi daha SDS çözünür ayrılabilir muhtemelen amiloid fibriller) Parçalar (Şekil 1B). SR fraksiyon immunoblotting, ardından filtre geriliği deneyleri ile tespit edilebilir iken, KG ve SS fraksiyonları Western blotting ile ve ardından SDS-PAGE ile analiz edilebilir. CHX Chase deterjanla paya ayırma yöntemi ile bir araya getirilmiş ve SS Atxn1 82Q yarılanma ömrü SS fraksiyonu kolaylıkla tanınan ve bozulmuş belirten NS Atxn1 82Q toplam Atxn1 82Q (Şekil 2A) çok daha kısa olduğu ortaya çıkmıştır hücrelerin 9. Böylece, bu yöntem yanlış katlanmış proteinlerin dinamiklerini incelemek için ve onların yıkım desen karşılaştırmak için güçlü bir araç sağlar.
Ayrıca yanlış katlanmış proteinleri bozulmasını modüle makromolekülleri veya küçük bileşiklerin belirlenmesi için yüksek miktarda madde taraması için uygun olan bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, ateşböceği lusiferaz (LucDM) 17 bir model şaperon alt-tabaka bir şekilsel olarak destabilize mutant dayanır. Biz sigorta varNükleer lokalizasyon sinyali (NLS) d LucDM algılama kolaylık olması için bu hücre bölmesine PQC sistemleri prob, ve GFP (NLS-LucDM GFP) için. Mikroskopik NLS-LucDM-GFP formları hücreleri (Şekil 3A) küçük bir yüzdesi görünür nükleer agrega. Atxn1 82Q, NLS-LucWT-GFP olduğu PML-RNF4 yolu 9'da SUMO2 / 3 tarafından değiştirilebilir ve regüle NLS-LucDM-GFP fakat vahşi tip muadili benzer. SS ve SR türlerin nispi miktarları NS göre minimum olmasına rağmen NLS-LucDM-GFP aşağıda protokol 3'te tarif edilen koşullar kullanılarak, SS ve SR türler oluşturur. tahlil basitleştirmek için, biz sadece SDS SDS-PAGE ve western blot ile (NS ve SS fraksiyonları hem dahil) çözünebilir LucDM analiz. Önemli olarak, CHX takip deneyi SDS çözünür NLS-LucDM-GFP yarı ömrü LucDM tanır ve dalgalanmalar sistemi için belirli bir alt-tabaka olduğunu düşündüren vahşi tip muadili (Şekil 3B) çok daha kısa olduğunu göstermiştirYanlış katlanmış proteinler.
LucDM-GFP bozulması genel flüoresan sinyalinde önemli bir düşüşe neden olur. Bu nedenle, aynı zamanda mikro floresans bazlı analiz kullamlarak hücresel LucDM-GFP gerçek zamanlı saptanması için bir protokol geliştirilmiştir. Bir çok yüksek girdi boyunca araştırma (HTS) sistemleri olarak anormal protein 18-20 neden olduğu hücre agregatları ve hücre canlılığı düzenleyici ilaçlar ya da gen için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, çok az HTSs özellikle memeli hücrelerinde bozulmasını hedefleme için tasarlanmıştır. Bu protokol, hücresel yanlış katlanmış protein parçalanması ile ilgili protein ifadesi, devirme ve ilaç tedavisinin etkileri hızlı ve büyük ölçekli analizi için sağlam bir sistem olarak hizmet vermektedir. Bu iki yanlış katlanmış proteinlerin analizi için protokoller tarif aşağıda, örnek olarak HeLa hücreleri kullanılarak. Transfeksiyon koşulları ve zaman süreci, her hücre hattı için optimize edilmesi gerekebilir, ancak deneyler ayrıca, diğer hücre çizgileri ile de uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
yanlış katlanmış proteinleri bozulmasını düzenleyen mekanizmaların hücresel proteinlerin dengesini sağlamaya yönelik olarak, ve muhtemelen, nörodejeneratif bozuklukların ve diğer protein yanlış katlayan hastalıkların tedavisi için değerli bir ilaç hedeflerini temsil eder. Burada, yanlış katlanmış proteinler bozunmasını incelenmesi deneyler, patojenik Atxn1 protein (Atxn1 82Q) ve örnek olarak bir nükleer lokalize lusiferaz mutant (NLS-LucDM) ile tarif edilmektedir.
<p class="jove_content"…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
Referências
- Dobson, C. M. Protein folding and misfolding. Nature. 426, 884-890 (2003).
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Trinucleotide repeat disorders. Annu Rev Neurosci. 30, 575-621 (2007).
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. . Handbook of Biological Statistics. 3, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
