فحوصات لتدهور تتجمع البروتينات في الخلايا
Summary
This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.
Abstract
Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.
Introduction
البروتينات هي الجزيئات الأكثر وفرة في الخلايا، وأنها تلعب دورا أساسيا في جميع العمليات الحيوية تقريبا. النشاط البيولوجي لمعظم البروتينات يتطلب قابلة للطي وبياناتهم إلى والمحافظة عليها، والأم هياكل ثلاثية الأبعاد. البروتينات مع التشكل الشاذة ليس فقط على فقدان وظائفهم العادية، ولكن أيضا في كثير من الأحيان تشكل الأنواع بلازميدة قليلة القسيمات القابلة للذوبان أو المجاميع التي تعوق وظائف بروتينات أخرى، وهي مواد سامة للخلايا 1،2. لمواجهة misfolding البروتين وخلايا توظف كل من المحرمين الجزيئية، التي تساعد البروتينية المطوية أو مطوية جزئيا للوصول إلى التشكل وطنهم، ومسارات التحلل، والتي تزيل البروتينات تتجمع 3. نظرا لتعقيد وطبيعة العشوائية لعملية قابلة للطي، والبروتين misfolding أمر لا مفر منه، وأنه قد لا يكون عكس في حالة من الطفرات، وأخطاء السكروز، والأضرار بعد متعدية 1. وبالتالي، فإن الخلايا تعتمد في نهاية المطاف على degradatمسارات أيون للحفاظ على نوعية البروتين.
وشدد على أهمية مراقبة الجودة البروتين الخلوي (PQC) نظم من قبل انتشار الأمراض misfolding البروتين، بما في ذلك السرطان والسكري والعديد من الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، التصلب الجانبي الضموري، مرض هنتنغتون (HD)، و الرنح النخاعي المخيخي (SCA) 4،5. على سبيل المثال، والطفرات في البروتين p53 الكابتة للورم هي الآفة الأكثر الوراثية في كثير من الأحيان واحدة في الأورام، ويرتبط مع ~ 50-70٪ من جميع حالات 6. وجزء كبير من الطفرات البروتين p53 والطفرات مغلطة التي تغير التشكل من البروتين p53، مما يؤدي إلى تشكيل المجاميع 7. علاوة على ذلك، وراثيا ومرضي البروتينات المرتبطة مع مساحات polyQ موسع مع HD وهيئة السلع التموينية. هذه الأمراض التقدمية وغالبا مميتة واضح عندما يتجاوز طول امتداد polyQ في البروتينات المتضررة معينة thresعقد، وتصبح شديدة على نحو متزايد على طول امتداد polyQ يطيل 8.
مقاربة جذابة لعلاج هذه الأمراض هو تعزيز علاجيا أنظمة PQC الخلوية، وخصوصا مسارات التحلل. ومع ذلك، فإن الممرات المشتركة في تدهور البروتينات التالفة، ولا سيما في خلايا الثدييات، لا تزال غير مفهومة. وعلى الرغم من الاعتراف بأن proteasome ومهم للغاية لتحلل البروتينات تتجمع، تبقى مسألة حيوية غير محددة: كيف البروتينات تتجمع معترف بها على وجه التحديد والمستهدفة للتدهور. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن أنظمة PQC تم تحديدها في مقصورات الخلوية بما في ذلك السيتوبلازم، الشبكة الإندوبلازمية، والحبيبات الخيطية، لا تزال أنظمة PQC في نواة واضحة 2.
وقد حددت الدراسات الأخيرة التي مختبرنا نظام يعترف ويحط مجموعة متنوعة من البروتينات تتجمع في النواةخلايا الثدييات من 9. ويتألف هذا النظام من البروتين البرولمفوسيت (الرابطة الاسلامية الباكستانية)، وهو بروتين النووي وعضوا في أسرة البروتين الثلاثية التي تحتوي على عزر (TRIM)، وRNF4، حلقة المجال تحتوي على البروتين. حزب الرابطة الاسلامية، والعديد من البروتينات TRIM أخرى، تمتلك سومو (صغير مثل اليوبيكويتين معدل) E3 النشاط يغاز، مما يسهل خصوصية وكفاءة البروتين SUMOylation 10. RNF4 ينتمي إلى مجموعة صغيرة من ligases اليوبيكويتين المستهدفة سومو (STUbL)، التي تحتوي على واحد أو أكثر من الزخارف-التفاعل السومو (بالمشترك) بالإضافة إلى المجال RING التي تتيح لهم النشاط يغاز اليوبيكويتين 11. وجدنا أن حزب الرابطة الاسلامية تعترف تحديدا البروتينات تتجمع من خلال مواقع التعرف على الركيزة المنفصلة التي يمكن أن نتبين سمات مميزة على البروتينات تتجمع. على الربط، والعلامات حزب الرابطة الاسلامية تتجمع البروتينات مع بولي سلاسل من SUMO2 / 3، اثنين من البروتينات SUMO الثدييات متطابقة تقريبا التي يمكن أن تشكل بولي سلاسل بسبب وجود موقع SUMOylation الداخلي. Sثم يتم التعرف على البروتينات تتجمع UMOylated التي كتبها RNF4، الأمر الذي يؤدي إلى ubiquitination وproteasomal تدهورها. أثبتنا أيضا أن نظام حزب الرابطة الاسلامية-RNF4 مهم للحماية من التنكس العصبي، ونقص في حزب الرابطة الاسلامية يفاقم من العيوب السلوكية وعصبية مرضية من نموذج الفأر من نوع SCA 1 (SCA1) 9.
للتمييز تدهور البروتين من الآليات الخلوية الأخرى التي يمكن أن تنظم مستويات البروتين، تم قياس معدلات دوران البروتين 9. من بين الأساليب الأكثر استخداما لتحديد دوران البروتين هي مطاردة النبض وسيكلوهيكسيميد (فروج) مطاردة. هاتين الطريقتين تدرس على مر الزمن، على التوالي، والبروتينات وصفت النظائر المشعة من الاهتمام في خلايا الترجمة يتقن ومجموع البروتينات الموجودة مسبقا من الفائدة في الخلايا تحول دون ترجمة. ومع ذلك، تحديا كبيرا لدراسة البروتينات المسببة للأمراض وعرضة للmisfolding هو أن عمر النصف لهذه البروتينات يمكن أن يكون لو للغايةنانوغرام. على سبيل المثال، Ataxin-1، Ataxin-7، هنتنغتين، ألفا-synuclein، وTDP-43 جميعا حياة نصف من أكثر من 12 إلى 24 ساعة 9،12-16. معدلات دوران بطيئة من هذه البروتينات تمنع استخدام تحليل فروج مطاردة لأن الخلايا إيواء هذه البروتينات قد لا البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة تثبيط الترجمة، خصوصا لأن البروتينات تتجمع أنفسهم يمكن أن تكون شديدة السمية للخلايا. تحليل نبض مطاردة مع وضع العلامات النظائر قد يكون أيضا تحديا للبروتينات التي تكون عرضة تجميع-للغاية. معظم فحوصات نبض مطاردة تعتمد على مناعي لفصل البروتين من الاهتمام من جميع البروتينات الأخرى التي هي أيضا المسمى بالإشعاع. ويشمل هذا الإجراء عادة مناعي وغسل الإجراءات المطولة خلالها المجاميع SDS-غير قابلة للذوبان يمكن أن تشكل، مما يجعل تحليل مع SDS-PAGE الكهربائي غير دقيقة.
هنا بروتوكول لتحليل البروتينات تتجمع النووية مع يوصف معدل دوران بطيء 9. ويستخدم شكلهما من Ataxin-1 (Atxn1) الذي يحتوي على امتداد 82 glutamines (Atxn1 82Q) لهذا الغرض (8). عندما أعرب في الخلايا، وتعزيز الخضراء بروتين فلوري (GFP) انصهار أشكال Atxn1 82Q مجهريا شوائب مرئية في نواة (الشكل 1A). ويكشف تحليل نبض مطاردة أن نصف عمر Ataxn1 82Q هي أكثر من 18 ساعة 9. يتكون Atxn1 82Q الأنواع مع التشكل تتجمع من خصائص مختلفة، فضلا عن الأنواع مع التشكل الأصلي. ومن المرجح أن هذه الأنواع تدهور بمعدلات مختلفة، وبالتالي يجب أن يتم تحليلها بشكل منفصل. لست] من Atxn1 82Q، معربا عن GFP ومجزأة الخلايا في NP-40 للذوبان (قابل للذوبان أو NS، من المرجح أن تمثل البروتينات الأم أو البروتينات أحادى / بلازميدة قليلة القسيمات تتجمع) و (NI، مجمعة / تتجمع) أجزاء NP-40-غير قابلة للذوبان. هذا الأخير يمكن تقسيمها الى مزيد من SDS للذوبان (SS، ومن المحتمل المجاميع المختلين) أو SDS مقاومة (SR، الألياف اميلويد المرجح) كسور (الشكل 1B). ويمكن تحليل NS و SS الكسور SDS-PAGE تليها النشاف الغربي، في حين يمكن أن يتم الكشف عن جزء ريال عن طريق فحوصات مرشح التخلف تليها immunoblotting. يتم الجمع بين فروج مطاردة مع أسلوب تجزئة المنظفات، واكتشفوا أن نصف عمر SS Atxn1 82Q أقصر بكثير من NS Atxn1 82Q ومجموعه Atxn1 82Q (الشكل 2A)، مشيرا إلى أن جزء SS يمكن التعرف بسهولة وتتحلل في الخلايا 9. وهكذا، وهذه الطريقة توفر أداة قوية لدراسة ديناميات البروتينات تتجمع ومقارنة نمط تدهورها.
وصفنا أيضا الأسلوب الذي هو مناسبة لفحص إنتاجية عالية لتحديد الجزيئات أو المركبات الصغيرة التي يمكن أن تعدل تدهور البروتينات تتجمع. ويستند هذا الأسلوب على متحولة مزعزع conformationally من وسيفيراز يراعة (LucDM) 17، ركيزة نموذج كوصي. لدينا الصماماتد LucDM إلى إشارة توطين النووية (NLS) للتحقيق في أنظمة PQC في هذا الحيز الخلوية، وGFP (NLS-LucDM-GFP) لتسهيل الكشف. أشكال NLS-LucDM-GFP مجهريا المجاميع النووية واضحة في نسبة صغيرة من الخلايا (الشكل 3A). على غرار Atxn1 82Q، NLS-LucDM-GFP، ولكن ليس في البرية من نوع نظيره NLS-LucWT-GFP-يتم تعديل من قبل SUMO2 / 3 والتي تخضع لرقابة مسار حزب الرابطة الاسلامية-RNF4 9. كما يشكل NLS-LucDM-GFP SS والأنواع ريال، على الرغم من أن كميات النسبية لقوات الأمن الخاصة والأنواع ريال ضئيلة مقارنة NS، وذلك باستخدام الشروط الواردة في بروتوكول 3 أدناه. لتبسيط الفحص، نقوم بتحليل فقط SDS LucDM للذوبان (بما في ذلك كل من NS وكسور SS) بواسطة SDS-PAGE وصمة عار الغربية. الأهم من ذلك، أظهر فروج مطاردة الفحص أن نصف عمر SDS للذوبان NLS-LucDM-GFP أقصر بكثير من أن لها من النوع البري نظيره (الشكل 3B)، مما يوحي بأن LucDM هو الركيزة محددة للنظام يقر ويحطالبروتينات تتجمع.
تدهور LucDM-GFP يؤدي إلى انخفاض كبير في إشارة مضان الشاملة. لذلك، وقد وضعنا أيضا على بروتوكول للكشف في الوقت الحقيقي الخلوية LucDM-GFP باستخدام فحص أساس مضان صفيحة. يتم تطوير العديد من الأنظمة شاشة عالية الإنتاجية (HTS) للعقاقير أو الجينات تعديل المجاميع الخلوية والجدوى الخلوية التي تسببها البروتينات الشاذة 18-20. ومع ذلك، فقد تم تصميم عدد قليل جدا HTSs خصيصا لاستهداف التدهور في خلايا الثدييات. يخدم هذا البروتوكول على أنه نظام قوي للتحليل واسع النطاق السريع ومن آثار تعبير البروتين، ضربة قاضية، والعلاج من تعاطي المخدرات على الخلوي تدهور البروتين تتجمع. باستخدام خلايا هيلا كمثال أدناه ونحن تصف بروتوكولات لتحليل هذه البروتينات تتجمع اثنين. يمكن أن تطبق أيضا على فحوصات للخطوط الخلايا الأخرى، على الرغم من الظروف ترنسفكأيشن وبالطبع الوقت قد يحتاج إلى أن يكون الأمثل لخطوط الخلايا الفردية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الآليات التي تنظم تدهور البروتينات تتجمع ضرورية للحفاظ على توازن البروتينات الخلوية، وعلى الأرجح أنها تمثل أهدافا المخدرات قيمة لعلاج الاضطرابات العصبية وغيرها من الأمراض misfolding البروتين. هنا، يتم وصف المقايسات التي تدرس تدهور البروتينات تتجمع، وذلك باستخدام بروت…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
Referências
- Dobson, C. M. Protein folding and misfolding. Nature. 426, 884-890 (2003).
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Trinucleotide repeat disorders. Annu Rev Neurosci. 30, 575-621 (2007).
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. . Handbook of Biological Statistics. 3, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
