测定法错误折叠的蛋白质在细胞中的降解
Summary
This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.
Abstract
Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.
Introduction
蛋白是在细胞中最丰富的大分子，和它们在几乎所有的生物过程中起重要作用。大多数蛋白的生物活性，需要其折叠成和维护，天然的三维结构。与异常的构象的蛋白不仅失去其正常功能，而且还常常形成削弱其它蛋白质的功能和对细胞有毒性，1,2-可溶性寡聚物种或聚集体。为了抵消蛋白质错误折叠，细胞同时采用分子伴侣，这有助于展开或部分折叠多肽达到自己的天然构象，和降解途径，从而消除错误折叠的蛋白质3。给出的复杂性和折叠处理的随机性质，蛋白错折叠是不可避免的，而且它可能无法在突变，生物合成的错误，以及翻译后的损害1的情况是相反的。因此，细胞最终依靠degradat离子通道以维持其蛋白质的质量。
细胞蛋白质的质量控制（PQC）系统的重要性，通过蛋白质错误折叠的疾病，包括癌症，糖尿病，和许多神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化症，亨廷顿氏病（HD）的患病率强调，和小脑萎缩症（SCA）4,5。例如，在肿瘤抑制基因p53的突变是唯一最频繁的遗传病变肿瘤，具有〜所有病例6 50-70％相关联。 p53基因突变的相当大的部分是改变p53的构象的错义突变，导致聚集体7的形成。此外，扩大的polyQ绵延蛋白基因和病理与HD和SCA相关。当的polyQ伸展在受影响的蛋白质的长度超过一定THRES这些进步和常常是致命的疾病表现持有，并作为的polyQ拉伸的长度延长8变得越来越严重。
用于治疗这些疾病的有吸引力的方法是将治疗加强蜂窝PQC系统，特别是降解途径。然而，涉及有缺陷的蛋白质，特别是那些在哺乳动物细胞中的降解途径，仍然知之甚少。尽管已经认识到，蛋白酶体为错误折叠的蛋白质的降解非常重要，一个至关重要的问题仍然是未定义：蛋白质如何错误折叠被特异性识别和针对降解。此外，尽管PQC系统在细胞区室，包括细胞质中，内质网和线粒体已经确定，在细胞核中的PQC系统仍不清楚2。
由我们实验室最近的研究已经确定了在细胞核中识别并降低各种错折叠蛋白的一个系统哺乳动物细胞中9。这个系统由早幼粒细胞蛋白（PML），核蛋白质和三方含基序（TRIM）蛋白质家族的一员，并RNF4，含蛋白质的RING结构域的。 PML等几个TRIM蛋白，具有SUMO（小泛素样修饰符）E3连接酶的活性，有利于蛋白SUMO化10的特异性和效率。 RNF4属于一个小团体SUMO-针对性的泛素连接酶（STUbL），其中包含在除了能提供他们泛素连接酶的活性在11 RING结构域的一个或多个相扑相互作用基序（SIMS）的。我们发现，PML特异性识别通过，可以在错误折叠的蛋白质辨别特色鲜明离散底物识别位点错误折叠的蛋白质。结合后，PML标签错误折叠与SUMO2 / 3的聚链，两个几乎相同的哺乳动物SUMO蛋白可以形成由于内部SUMO化位点的存在聚链蛋白质。小号UMOylated错误折叠的蛋白质，然后通过RNF4，从而导致它们的泛素化和蛋白酶体降解的认可。我们进一步证明了PML-RNF4系统是针对神经变性保护重要的，因为缺乏在PML加剧SCA类型的小鼠模型1（SCA1）9的行为和神经病理学缺陷。
若要从可调节蛋白水平等细胞机制区分蛋白质降解，蛋白质周转率测量9。其中最常用的方法，以确定蛋白质周转是脉冲追踪和放线菌酮（CHX）追。这两种方法考察随着时间的推移，分别翻译，精通细胞和翻译，抑制细胞的总利息预先存在的蛋白质感兴趣的放射性同位素标记的蛋白质。但是，对于学习致病和错误折叠倾向的蛋白质的一个主要的挑战是，这些蛋白质的半衰期可以是非常罗NG。例如，共济失调蛋白1，共济失调蛋白7，亨廷顿，α突触核蛋白，和TDP-43都具有超过12的半衰期至24小时9,12-16。这些蛋白质的慢流动率排除使用CHX追分析的，因为携带这些蛋白质的细胞可能无法生存延长翻译抑制，特别是因为错误折叠的蛋白质本身可以是细胞毒性很强。用同位素标记的脉冲追踪分析还可以是对于那些高度聚集倾向的蛋白质具有挑战性。最脉冲追踪测定依赖于免疫沉淀到感兴趣的蛋白质从也放射性标记的所有其他蛋白质分离。此过程通常包括冗长免疫沉淀和洗涤过程，在此期间，SDS不溶聚集体可以形成，使得用SDS-PAGE电泳不精确的分析。
这里用一个缓慢的周转率说明9协议分析核错误折叠的蛋白质。包含的82个谷氨酰胺（Atxn1 82Q）拉伸共济失调蛋白-1（Atxn1）的致病形式用于此目的8。当在细胞中表达的Atxn1 82Q形式显微镜可见夹杂物的增强型绿色荧光蛋白（GFP）融合在细胞核中（ 图1A）。脉冲追踪分析表明Ataxn1 82Q的半衰期为18小时以上，9。 Atxn1 82Q是由具有不同特性的错折叠的构象，以及具有天然构象物种物种。它很可能是这些物种以不同的速率退化，并因此应该被单独分析。裂解物从Atxn1 82Q-GFP表达细胞被分馏成NP-40的水溶性（可溶于或生理盐水，可能代表天然蛋白质或错误折叠的单体/低聚物的蛋白）和NP-40的不溶性（NI，凝集/错折叠）部分。后者可进一步分为SDS可溶性（SS;可能无序集合体）或SDS抗性（SR;可能淀粉样蛋白原纤维）馏分（ 图1B）。 NS和SS馏分可以通过SDS-PAGE，随后通过Western印迹进行分析，而对SR分数可以通过过滤相位差测定，随后通过免疫印迹进行检测。 CHX追与洗涤剂分馏方法相结合，并且发现SS Atxn1 82Q的半衰期比NS Atxn1 82Q和总Atxn1 82Q（ 图2A）的短得多，这表明在SS馏分可以容易地识别和降解在细胞中9。因此，该方法提供了一个有力的工具来研究错误折叠的蛋白质的动态，并比较它们的降解模式。
我们还描述了适合于用于识别大分子或小分子化合物可以调节错误折叠的蛋白质的降解的高通量筛选的方法。此方法是基于萤火虫荧光素酶（LucDM）17，一个模型伴侣衬底的构象失稳突变体。我们有保险丝ðLucDM到一个核定位信号（NLS）来探测在此细胞区室的PQC系统，和GFP（NLS-LucDM-GFP）进行检测的便利性。 NLS-LucDM-GFP形式显微镜中的细胞（ 图3A）的一小部分可见核聚集体。类似Atxn1 82Q，NLS-LucDM-GFP-而不是它的野生型对应物NLS-LucWT-GFP-由SUMO2 / 3改性和调节由PML-RNF4通路9。 NLS-LucDM-GFP也形成SS和SR物种，虽然SS和SR物种的相对量相比NS是最小的，使用下文协议3所述的条件。为了简化分析，我们只分析SDS可溶性LucDM（包括NS和SS分数两者）通过SDS-PAGE和免疫印迹。重要的是，CHX追检测显示SDS可溶性NLS-LucDM-GFP的半衰期比其野生型对应物（ 图3B）的短得多，这表明LucDM为承认和降解系统中的特定基板错误折叠的蛋白质。
LucDM-GFP的降解导致整体荧光信号的显著下跌。因此，我们还开发了使用基于荧光微量测定细胞LucDM-GFP的实时检测的协议。许多高通量筛选（HTS）系统的药物或基因修饰的细胞聚集和细胞活力造成的异常蛋白质18-20发展。然而，很少HTSS是专门用于在哺乳动物细胞靶向降解而设计的。此协议可作为蛋白质表达，击倒，和药物治疗对细胞错折叠蛋白质降解的影响快速和大规模分析一个健壮的系统。使用HeLa细胞作为例子，下面我们描述了协议，这两个错误折叠的蛋白质的分析。该测定法还可以应用到其他的细胞系，虽然转染的条件和时间过程中可能需要对个别细胞系进行优化。
Protocol
Representative Results
Discussion
调节错误折叠的蛋白质的降解机制是用于维持细胞蛋白质的稳态必不可少的，并且它们可能代表用于治疗神经变性疾病和其他蛋白质错误折叠的疾病有价值的药物靶标。这里，检查错误折叠的蛋白质的降解测定法所述，用致病Atxn1蛋白（Atxn1 82Q）和核局部化的萤光素酶突变体（NLS-LucDM）作为例子。
为了检查降解Atxn1 82Q，具有半衰期超过18小时，我们介绍了细胞分离与经典CHX <su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
Referências
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