Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine in Zellen
Summary
This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.
Abstract
Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.
Introduction
Proteine sind die am häufigsten vorkommenden Makromolekülen in Zellen, und sie spielen eine wesentliche Rolle in praktisch allen biologischen Prozessen. Die biologische Aktivität der meisten Proteine erfordert deren Faltung in und Wartung, die nativen dreidimensionalen Strukturen. Proteine mit aberranter Konformationen nicht nur ihre normale Funktion verlieren, sondern auch bilden häufig lösliche oligomere Spezies oder Aggregate, die die Funktionen von anderen Proteinen beeinträchtigen und sind toxisch für Zellen 1,2. Um dem entgegenzuwirken , falsch gefaltete Proteine, verwenden Zellen , die beide molekulare Chaperone, die entfaltete oder teilweise gefaltete Polypeptide unterstützen , um ihre native Konformation zu erreichen, und Abbauwege, die falsch gefaltete Proteine 3 zu beseitigen. Angesichts der Komplexität und der stochastischen Natur des Faltvorgangs, Protein misfolding unvermeidlich, und es kann nicht in dem Fall von Mutationen, biosynthetische Fehler umgekehrt werden, und posttranslationale Schäden 1. Daher verlassen Zellen schließlich auf degradatIonenwege, um ihre Proteinqualität aufrecht zu erhalten.
Die Bedeutung der zellulären Proteinqualitätskontrolle (PQC) -Systemen wird durch das Vorherrschen von Protein-Fehlfaltungen Krankheiten, einschließlich Krebs, Diabetes, und viele neurodegenerative Störungen wie Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Huntington-Krankheit (HD) unterstrichen, und spinocerebellar Ataxien (SCA) 4,5. Beispielsweise Mutationen in dem p53 – Tumorsuppressor ist die einzige am häufigsten genetischen Läsion in Tumoren, verbunden mit ~ 50-70% aller Fälle 6. Ein wesentlicher Anteil von p53 – Mutationen sind Missense – Mutationen , welche die Konformation von p53, was zur Bildung von Aggregaten 7 verändern. Darüber hinaus Proteine mit erweiterter polyQ Strecken sind genetisch und pathologisch mit HD und SCA in Verbindung gebracht. Diese progressiven und oft tödlichen Krankheiten manifestieren, wenn die Länge des polyQ Strecke in den betroffenen Proteine eine bestimmte THRES überschreitethalten, und wird zunehmend schwerer als die Länge des polyQ Strecke 8 verlängert.
Ein vielversprechender Ansatz, diese Krankheiten zu behandeln ist, um therapeutisch zellulären PQC Systeme zu stärken, insbesondere die Abbauwege. Jedoch involviert die Wege in der Degradation von fehlerhaften Proteine, insbesondere solche, in Säugerzellen, bleiben wenig verstanden. Obwohl es erkannt wurde, dass das Proteasom für den Abbau von falsch gefalteten Proteine von entscheidender Bedeutung ist, ein zentrales Thema bleibt undefiniert: wie falsch gefaltete Proteine sind für den Abbau spezifisch erkannt und zielgerichtet. Darüber hinaus, obwohl PQC Systeme in zellulären Kompartimenten einschließlich Zytoplasma identifiziert wurden, dem endoplasmatischen Retikulum und dem Mitochondrium, bleiben die PQC Systeme im Kern unklar 2.
Neuere Studien von unserem Labor haben ein System identifiziert, das eine Vielzahl von falsch gefalteten Proteinen in den Zellkern erkennt und verschlechtertvon Säugerzellen 9. Dieses System besteht aus dem promyelocytic Protein (PML), einem Kernprotein und einem Mitglied des tripartite motif enthaltenden (TRIM) Proteinfamilie und RNF4, eine RING-Domäne enthaltendes Protein. PML und mehrere andere Proteine TRIM besitzen SUMO (small ubiquitin-like Modifier) E3 – Ligase – Aktivität, die die Spezifität und Effizienz der Protein SUMOylierung 10 erleichtert. RNF4 gehört zu einer kleinen Gruppe von SUMO-bezogene Ubiquitinligasen (Stübl), die einen oder mehrere Sumo-interacting Motive (SIMs) zusätzlich zu der RING – Domäne , die ihnen die Ubiquitin – Ligase – Aktivität 11 bietet. Wir fanden, dass PML erkennt spezifisch misfolded Proteine durch einzelne Substraterkennungsstellen, die unterschiedliche Merkmale auf falsch gefaltete Proteine erkennen können. Bei der Bindung, PML-Tags fehlgefaltetem Proteine mit poly-Ketten von SUMO2 / 3, zwei nahezu identische Säuger SUMO Proteine, die poly-Ketten aufgrund der Existenz eines internen SUMOylierung Stelle bilden kann. SUMOylated misfolded Proteine werden dann durch RNF4 erkannt, die ihre Ubiquitinierung und Abbau im Proteasom führt. Wir haben gezeigt , weiter , dass die PML-RNF4 System zum Schutz gegen Neurodegeneration wichtig, da Mangel in PML die Verhaltens- und neuropathologischen Defekte eines Mausmodells von SCA Typ 1 (SCA1) 9 verschärft.
Um den Proteinabbau von anderen zellulären Mechanismen unterscheiden , die Proteinspiegel regulieren kann, wurde die Rate der Proteinumsatz 9 gemessen. Unter den am häufigsten verwendeten Methoden Proteinumsatz sind Puls Chase und Cycloheximid (CHX) Jagd zu bestimmen. Diese beiden Methoden untersuchen, über die Zeit bzw. die Radioisotop-markierte Proteine von Interesse in übersetzungs bewandert Zellen und Gesamt vorbestehenden Proteine von Interesse in Translation-inhibierten Zellen. Allerdings ist eine große Herausforderung, pathogene und Fehlfaltungen neigende Proteine für die Untersuchung, dass die Halbwertszeit dieser Proteine extrem lo sein kannng. Beispielsweise Ataxin-1, Ataxin-7, Huntingtin, α-Synuclein und TDP-43 haben alle Halbwertszeit von mehr als 12 bis 24 h 9,12-16. Die langsamen Umsatzraten dieser Proteine schließen die Verwendung der Analyse CHX chase, weil die Zellen, die diese Proteine beherbergen kann nicht längere Übersetzung Hemmung überleben, vor allem weil die misfolded Proteine können selbst hochtoxisch für Zellen sein. Die Pulse-Chase-Analyse mit Isotopenmarkierung kann auch für Proteine eine Herausforderung sein, die stark zur Aggregation neigen. Die meisten Pulse-Chase-Assays beruhen auf Immunpräzipitation des Proteins von Interesse von den anderen Proteinen abzutrennen, die auch radioaktiv markiert sind. Dieses Verfahren umfasst in der Regel langwierig Immunpräzipitation und Waschverfahren, bei dem SDS-unlösliche Aggregate bilden können, ungenaue die Analyse mit SDS-PAGE-Elektrophorese zu machen.
Hier ist ein Protokoll zur nuklearen misfolded Proteine analysieren mit einem langsamen Umsatzrate 9 beschrieben wird ,. Eine pathogene Form von Ataxin-1 (ATXN1) , die eine Strecke von 82 Glutamine (ATXN1 82Q) enthält , wird zu diesem Zweck 8 verwendet. Wenn in Zellen exprimiert wird , eine verstärkte grün fluoreszierende Protein (GFP) Fusion von ATXN1 82Q Formen mikroskopisch sichtbare Einschlüsse im Kern (1A). Pulse – Chase – Analyse zeigt , dass die Halbwertszeit von Ataxn1 82Q ist über 18 Stunden 9. ATXN1 82Q mit misfolded Konformationen unterschiedlicher Eigenschaften von Arten zusammengesetzt, sowie Spezies mit nativer Konformation. Es ist wahrscheinlich, dass diese Arten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten abgebaut werden, und sollte daher separat analysiert werden. Lysate aus ATXN1 82Q-GFP-exprimierenden Zellen werden fraktioniert in NP-40-löslich (löslich oder NS, wahrscheinlich repräsentieren native Proteine oder falsch gefaltete monomeren / oligomeren Proteine) und NP-40-unlöslichen (NI, aggregiert / misfolded) Portionen. Letztere kann weiter in SDS-löslichen (SS; wahrscheinlich ungeordnete Aggregate) unterteilt werden oder SDS-resistenten (SR; wahrscheinlich Amyloidfibrillen) Fraktionen (1B). NS und SS-Fraktionen können durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot, während der SR-Fraktion durch Filterverzögerungs Assays detektiert werden kann durch Immunoblotting gefolgt analysiert werden. CHX chase wird mit dem Detergens Fraktionierungsverfahren kombiniert und entdeckt , dass die Halbwertszeit von SS ATXN1 82Q ist viel kürzer als die von NS ATXN1 82Q und insgesamt ATXN1 82Q (2A), was darauf hinweist , dass die SS – Fraktion leicht erkannt und abgebaut in Zellen 9. Somit stellt diese Methode ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik von falsch gefalteten Proteine zu untersuchen und deren Abbaumuster zu vergleichen.
Wir beschreiben auch ein Verfahren, das für Hochdurchsatz-Screening zur Identifizierung von Makromolekülen oder kleinen Verbindungen geeignet ist, die den Abbau fehlgefalteter Proteine modulieren können. Dieses Verfahren basiert auf einer konformationell destabilisiert Mutante von Glühwürmchen – Luciferase (LucDM) 17, einem Modell Chaperon Substrat. Wir haben Sicherungd LucDM zu einem Kernlokalisationssignal (NLS), die PQC Systeme in diesem Zellkompartiment zu sondieren, und GFP (NLS-LucDM-GFP) zur Erleichterung der Erkennung. NLS-LucDM-GFP Formen mikroskopisch sichtbare Kern Aggregate in einem kleinen Prozentsatz der Zellen (3A). Ähnlich wie bei ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP-aber nicht seine Wildtyp – Gegenstück NLS-LucWT-GFP-durch SUMO2 / 3 modifiziert und reguliert durch die PML-RNF4 Weg 9. NLS-LucDM-GFP bildet auch SS und SR-Arten, obwohl die relativen Mengen von SS und SR Spezies minimal sind im Vergleich zu NS, unter Verwendung der in Protokoll 3 unten beschriebenen Bedingungen. Um den Assay zu vereinfachen, analysieren wir nur SDS löslich LucDM (einschließlich sowohl der NS und SS-Fraktionen) durch SDS-PAGE und Western Blot. Wichtig ist , zeigte CHX chase – Assay , dass die Halbwertszeit von SDS-löslichen NLS-LucDM-GFP ist viel kürzer als die der Wildtyp – Gegenstück (3B), was darauf hindeutet , dass LucDM ein spezifisches Substrat für das System ist , das und verschlechtert erkenntmisfolded Proteine.
Der Abbau von LucDM-GFP führt zu einem deutlichen Rückgang der Gesamtfluoreszenzsignal. Daher haben wir entwickelt auch ein Protokoll für Echtzeit-Erkennung von zellulärer LucDM-GFP Fluoreszenz basierenden Assay unter Verwendung von Mikrotiterplatten. Viele Hochdurchsatz – Screening (HTS) Systeme für Medikamente oder Gene Zellaggregaten und zelluläre Lebensfähigkeit durch anomale Proteine 18-20 verursacht Modifikation entwickelt. Jedoch sind sehr wenige HTS speziell für den Abbau in Säugerzellen abzielt. Dieses Protokoll dient als robustes System für die schnelle und umfangreiche Analyse der Auswirkungen der Proteinexpression, Knockdown und medikamentöse Behandlung auf die zelluläre misfolded Proteinabbau. Verwendung von HeLa-Zellen, wie beispielsweise unterhalb wir die Protokolle für die Analyse dieser beiden misfolded Proteine beschreiben. Die Assays können auch auf andere Zelllinien angewendet werden, obwohl Transfektionsbedingungen und Zeitverlauf benötigen für einzelne Zelllinien optimiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mechanismen, die den Abbau fehlgefalteter Proteine sind wesentlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase zellulärer Proteine reguliert, und sie stellen wahrscheinlich wertvolle Arzneimittelziele für neurodegenerative Erkrankungen und anderen eiweiß misfolding Behandlung von Krankheiten. Hier Assays, die den Abbau fehlgefalteter Proteine untersuchen, werden beschrieben, eine pathogene ATXN1 Protein (ATXN1 82Q) und einem Kern lokalisierten Luciferase-Mutante (NLS-LucDM) als Beispiele verwendet. <…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
Referências
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