Protocole pour la conversion directe des fibroblastes embryonnaires murins en trophoblaste cellules souches

Summary

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Abstract

cellules souches Trophoblast (TSCs) surviennent à la suite de la première décision du destin cellulaire dans le développement des mammifères. Ils peuvent être cultivées in vitro, en conservant la capacité d'auto-renouvellement et de se différencier en tous les sous – types de la lignée de trophoblaste, ce qui équivaut à l'in vivo de cellules souches population donnant lieu à la partie fœtale du placenta. Par conséquent, TSCs offrent un modèle unique pour étudier le développement placentaire et embryonnaire par rapport extra-embryonnaire décision du destin cellulaire in vitro. Dès le stade de blastocyste partir, une barrière épigénétique distincte composée de méthylation de l'ADN et les histones modifications sépare hermétiquement les deux lignées. Ici, nous décrivons un protocole pour surmonter complètement cette lignée barrière par transitoire sur-expression de trophoblaste régulateurs clés Tfap2c, Gata3, Eomes et Ets2 dans les fibroblastes embryonnaires murins. Les cellules souches trophoblastiques induites sont capables d'auto-renouvellement et sont presque identiques à blastocyste cellules souches trophoblaste dérivées in termes de morphologie, l'expression du gène marqueur et modèle de méthylation. Fonctionnelle in vitro et in vivo confirment que ces cellules sont capables de se différencier le long de la lignée trophoblastique générer des cellules géantes trophoblastiques et polyploïdes chimerizing le placenta lorsqu'elles sont injectées dans des blastocystes. L'induction de cellules souches du trophoblaste à partir du tissu somatique ouvre de nouvelles voies pour étudier les caractéristiques génétiques et épigénétiques de cette lignée extra-embryonnaire et offre la possibilité de générer des lignées de cellules souches du trophoblaste sans détruire l'embryon respectif.

Introduction

Récemment, une étude comparant plusieurs approches de la souris les cellules souches embryonnaires à trophoblaste conversion des cellules souches a révélé que, dans tous les systèmes analysés, la conversion de la lignée est restée incomplète. Au lieu de cellules souches induites ( le trophoblaste) de SSII dite tige de trophoblaste cellules analogues à des cellules ont été générées en conservant une mémoire du destin cellulaire d'origine ^1. Ici, nous avons suivi une approche différente de la génération CSTI. Similaire à l'induction directe de cellules souches pluripotentes à partir de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ^2, SSII ont été directement converti à partir du tissu somatique différencié. Tout d'abord, nous avons identifié 12 facteurs candidats induisant TSC sort lorsque surexprimé dans MEFs. Plus tard, les facteurs Tfap2c, Gata3, Eomes et Ets2 ont été identifiés pour être nécessaire et suffisante pour l'induction ITSC ^3. En même temps, un autre groupe a trouvé indépendamment Tfap2c, Gata3 et Eomes être suffisante pour convertir en MEFs SSII. Toutefois, en ce qu 'étude, le temps nécessaire pour l' expression du transgène est considérablement plus longue par rapport à notre étude, ce qui indique une cinétique différente de conversion, lorsque Ets2 est absent de la transdifférenciation cocktail ^4.

Sérum bovin fœtal conventionnel (FBS) contenant la culture de cellules souches dérivées du trophoblaste blastocyste induites et repose sur la présence de facteurs sécrétés par les MEFs de croissance inactivé ^5,6. Au cours de l'induction ITSC, ces facteurs sont fournis par MEF, qui manquent la combinaison complète de transgènes et ne subissent pas transdifférenciation. Cependant, les colonies individuelles une fois CSTI sont sous-culture, ils ont besoin des médias, qui a été préconditionnés par MEFs de croissance inactivé. A partir de là, SSII peuvent être cultivées et traitées comme blastocyste dérivé TSCs selon des protocoles standards. Il faut noter que contrairement à Tanaka et al. , ^5, on systématiquement la culture TSC et sans gélatiniser SSII des boîtes de culture cellulaire.

Protocol

Toutes les expériences de souris ont été menées conformément à la loi allemande de protection des animaux et en accord avec l'approbation des comités locaux de protection des animaux institutionnels (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Rhénanie du Nord-Westphalie [approbation Numéro d'identification: AZ 84-02.04.2013 .A428]). 1. Préparation des médias Préparer le milieu 293T: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) de FBS, L-gl…

Representative Results

Sur le plat où l' expression du transgène de la 4F est activée, les cellules changent rapidement morphologie (comparer Figure 2A et B). Autour de 14 jours – 21 régions transdifferentiated distinctes émergent (deux exemples sont donnés dans la figure 2B et C). Ces colonies primaires manquent morphologie typique TSC; mais une fois qu'ils sont sous-culture, morphologie caractéristique épithéliale avec des bords serrés et des limites claire…

Discussion

Le 4 facteur (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) Protocole de transdifférenciation basé présenté ici offre une méthode fiable pour générer fidèlement converti à partir de fibroblastes embryonnaires SSII de souris. En outre, la méthode est également applicable pour les post-natal des fibroblastes de la queue, mais avec une baisse de l'efficacité par rapport à des fibroblastes embryonnaires ^3. En général, la qualité des fibroblastes primaires est un facteur critique de transdifférenciation résult…

Materials

Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-10G	Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C
Chloroquine diphosphate salt	Sigma-Aldrich	C6628-25G	Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4	ReliaTech	300-131L	Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C
ProFection Mammalian Transfection System	Promega	E1200
PBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640, no glutamine	ThermoFisher Scientific	31870-025
Advanced DMEM (1x)	ThermoFisher Scientific	12491-015
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300-054
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30071.03IR
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter	Corning	431220
Non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140-035
Penicillin Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122
Sodium Pyruvate	ThermoFisher Scientific	11360-039
L-glutamine	ThermoFisher Scientific	25030-24
2-Mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	31350-010
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-Gata3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA	Addgene	19780
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7	JAX Mice	6965
129S2SV	Charles River	129