פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast
Summary
Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.
Abstract
תאי גזע Trophoblast (TSCs) העולות אגב החלטת גורל התא הראשונה בפיתוח יונק. הם יכולים להיות מתורבת במבחנה, שמירה על היכולת העצמית לחדש להתמיין בכל תתי הסוגים של השושלת trophoblast, שווה ערך ל vivo ב גזע עלייה נותן אוכלוסיית תאים לחלק העוברי של השליה. לכן, TSCs מציע מודל ייחודי ללמוד פיתוח שליה עוברי לעומת החלטת גורל תא חוץ עוברית במבחנה. משלב הבלסטוציסט ואילך, מחסום אפיגנטיים מובחן המורכב שינויים מתילציה דנ"א היסטון בחוזקה מפריד הוא שושלות. כאן אנו מתארים פרוטוקול להתגבר על זה המכשול השושלת באופן מלא על ידי חולף ביטוי יתר של רגולטורים מרכזיים trophoblast Tfap2c, Gata3, Eomes ו Ets2 ב פיברובלסטים עובריים בעכברים. תאי גזע trophoblast המושרה מסוגלים עצמי לחדש והם כמעט זהים הבלסטוציסט תא גזע trophoblast נגזר iבמונחי n של מורפולוגיה, ביטוי גנים סמנו דפוס מתילציה. תפקודי במבחנת מבחני vivo לאשר כי התאים האלה מסוגלים להבחין לאורך שושלת trophoblast יוצרת תאים ענקים trophoblast polyploid ו chimerizing השליה כאשר מזריקה blastocysts. האינדוקציה של תאי גזע trophoblast מרקמות סומטיים פותחת אפיקים חדשים ללמוד את מאפיינים גנטיים אפיגנטיים של שושלת חוץ עוברית זה, ומציעה את האפשרות ליצור שורות תאי גזע trophoblast מבלי להרוס את העובר בהתאמה.
Introduction
לאחרונה, במחקר שהשווה כמה גישות של תאי גזע עוברי בעכבר כדי Trophoblast המר גזע תאים גילה כי בכל המערכות המנותחות, מרת שושלת נשארת שלמה. במקום תאי גזע trophoblast המושרה (iTSCs) שנקראים גזע trophoblast תאים דמויי תאים נוצרו שמירה על זיכרון של תא גורל ממוצא 1. כאן פעלנו ע"פ גישה שונה של דור iTSC. בדומה האינדוקציה הישירה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מ פיברובלסטים עובריים בעכברים (MEFs) 2, iTSCs הומר ישירות מרקמת סומטיים מובחנת. ראשית, זיהינו 12 גורמי מועמד התרמת גורל TSC כאשר ביתר MEFs. בהמשך, הגורמים Tfap2c, Gata3, Eomes ו Ets2 זוהו להיות הכרחי ומספיק אינדוקציה iTSC 3. במקביל, קבוצה נוספת באופן עצמאי מצאו Tfap2c, Gata3 ו Eomes להיות בהן כדי להפוך את MEFs לתוך iTSCs. עם זאת, באותהמחקר, הזמן הנדרש ביטוי transgene מושווה הרבה יותר זמן במחקר שלנו, המציין קינטיקה מרה שונה, כאשר Ets2 תיאור מקוקטייל transdifferentiation 4.
בסרום שור עובר קונבנציונלי (FBS) המכיל תרבות של מושרה בתאי גזע trophoblast נגזר הבלסטוציסט מסתמך על הנוכחות של גורמים המופרשים MEFs מומת צמיחה 5,6. במהלך אינדוקצית iTSC, הגורמים הללו ניתנים על ידי MEFs, אשר חסרים את השילוב המלא של transgenes ואינם עובר transdifferentiation. עם זאת, ברגע הפרט מושבות iTSC הם תת תרבות, הם דורשים מדיה, אשר כבר preconditioned ידי MEFs צמיחה מומת. משם ואילך, iTSCs יכול להיות מתורבת ומטופל כמו TSCs הבלסטוציסט נגזר על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. מן הראוי לציין כי, בניגוד טנקה et al. 5, אנו שגרתי תרבות TSCs ו iTSCs ללא gelatinizing מנות תרבית תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
גורם 4 (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) פרוטוקול transdifferentiation המבוסס שהוצג כאן מציע שיטה אמינה לייצר המרת בנאמנות iTSCs מ פיברובלסטים עובריים בעכבר. יתר על כן, השיטה היא גם ישימה עבור פיברובלסטים זנב שלאחר לידה, אם כי עם ירידה יעילה לעומת פיברובלסטים עובריים 3. באופן כללי, איכות פיבר?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
Referências
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
