Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Summary

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Abstract

células-tronco trofoblasto (CET) surgem como consequência da primeira decisão destino celular no desenvolvimento dos mamíferos. Eles podem ser cultivadas in vitro, conservando a capacidade de auto-renovação e de se diferenciar em todos os subtipos da linhagem trofoblasto, equivalente ao in vivo haste população de células que dá origem à porção fetal da placenta. Portanto, TSCs oferecer um modelo único para estudar o desenvolvimento da placenta e embrionárias contra decisão destino celular extra-embrionário in vitro. Desde a fase de blastocisto em diante, uma barreira epigenética distinto constituído por metilação do DNA e histonas modificações firmemente separa as duas linhagens. Aqui, descrevemos um protocolo para superar totalmente essa barreira linhagem pela transitória sobre-expressão de trofoblastos reguladores chave Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 em fibroblastos embrionárias de ratinho. As células-tronco induzidas trofoblastos são capazes de auto-renovação e são quase idênticas às blastocisto células-tronco trofoblasto derivados in termos de morfologia, expressão do gene marcador e padrão de metilação. Funcional in vitro e em ensaios in vivo confirmam que estas células são capazes de se diferenciar ao longo da linhagem trofoblasto gerar células trofoblásticas gigantes poliplóide e chimerizing a placenta quando injectadas em blastocistos. A indução de células estaminais a partir de tecido somático trofoblasto abre novas vias para estudar as características genéticas e epigenética desta linhagem extra-embrionárias e oferece a possibilidade de gerar linhas de células estaminais trofoblasto sem destruir o respectivo embrião.

Introduction

Recentemente, um estudo comparando várias abordagens de células-tronco embrionárias mouse para Trophoblast conversão de células-tronco revelou que em todos os sistemas analisados, a conversão da linhagem permaneceu incompleto. Em vez de células estaminais induzidas trofoblasto (iTSCs) chamados haste trofoblasto células semelhantes a células foram gerados reter uma memória do destino celular de origem ^1. Aqui, seguimos uma abordagem diferente da geração de ITSC. Semelhante à indução directa de células estaminais pluripotentes a partir de fibroblastos embrionários de murídeo (MEFs) ^2, iTSCs foram convertidos directamente a partir de tecido somático diferenciada. Em primeiro lugar, foram identificados 12 fatores candidatos indutores TSC destino quando overexpressed em MEFs. Mais tarde, os fatores Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 foram identificados como sendo necessária e suficiente para a indução ITSC ^3. Simultaneamente, outro grupo verificou independentemente Tfap2c, GATA3 e Eomes ser suficiente para converter em MEFs iTSCs. No entanto, nesseestudo, o tempo necessário para a expressão do transgene é consideravelmente mais longa em comparação com o nosso estudo, indicando diferentes cinéticas de conversão, quando ETS2 está ausente do cocktail transdiferenciação ^4.

Soro fetal convencional de bovino (FBS) contendo a cultura de células estaminais trofoblásticas blastocisto derivado induzidas e baseia-se na presença de factores segregados por MEFs inactivado pelo crescimento ^5,6. Durante a indução ITSC, esses fatores são fornecidos por MEFs, que não têm a combinação cheia de transgenes e não são submetidos a transdiferenciação. No entanto, uma vez ITSC colónias individuais são sub-cultivadas, que exigem meios de comunicação, o qual foi pré-condicionada por MEFs inactivado pelo crescimento. A partir daí, iTSCs podem ser cultivadas e tratadas como blastocisto TSCs derivado de acordo com protocolos padrão. É de notar, em contraste com Tanaka et al. ^5, que rotineiramente cultura CET e gelatinizar iTSCs sem pratos de cultura de células.

Protocol

Todas as experiências de rato foram conduzidos de acordo com a lei alemã de protecção dos animais e de acordo com a aprovação dos comités Institutional Animal Care locais (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia [número de identificação de aprovação: AZ 84-02.04.2013 .A428]). 1. Preparação de Meios Prepare forma 293T: de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% (v / v) de FBS, L-glutamina (2 mM), piruvato de sódio (1 mM), penici…

Representative Results

No prato onde a expressão do transgene do 4F é activado, as células mudam rapidamente morfologia (comparar a Figura 2A e B). Por volta do dia 14 – 21 transdifferentiated áreas distintas emergem (dois exemplos são apresentados na Figura 2B e C). Estas colónias primárias não possuem morfologia típica TSC; No entanto, uma vez que são sub-cultivadas, a morfologia característica epitelial com bordas apertadas e limites brilhantes altamente reminisc…

Discussion

O protocolo de transdiferenciação baseado 4 fator (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) aqui apresentado oferece um método confiável para gerar fielmente convertido iTSCs de fibroblastos de rato embrionárias. Além disso, o método é também aplicável para os fibroblastos da cauda de pós-natal, apesar de com uma queda na eficácia em comparação com os fibroblastos embrionários ^3. Em geral, a qualidade de fibroblastos primários é um fator crítico de resultado transdiferenciação e deve ser tomado cuidado…

Materials

Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-10G	Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C
Chloroquine diphosphate salt	Sigma-Aldrich	C6628-25G	Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4	ReliaTech	300-131L	Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C
ProFection Mammalian Transfection System	Promega	E1200
PBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640, no glutamine	ThermoFisher Scientific	31870-025
Advanced DMEM (1x)	ThermoFisher Scientific	12491-015
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300-054
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30071.03IR
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter	Corning	431220
Non-essential amino acids	ThermoFisher Scientific	11140-035
Penicillin Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122
Sodium Pyruvate	ThermoFisher Scientific	11360-039
L-glutamine	ThermoFisher Scientific	25030-24
2-Mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	31350-010
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-Gata3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA	Addgene	19780
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7	JAX Mice	6965
129S2SV	Charles River	129