Préparation et applications de cultures organotypiques de thymus Slice
Summary
Nous décrivons la préparation de tranches thymiques qui, en combinaison avec la cytométrie de flux, peuvent être utilisés pour modéliser la sélection positive et négative de développer des cellules T. Tranches thymiques peuvent également être adaptées pour l'analyse in situ de la migration des thymocytes, la localisation et la signalisation via immunofluorescence et la microscopie à deux photons.
Abstract
Thymiques produit de sélection dans un microenvironnement thymique unique et hautement organisée aboutissant à la génération d'un répertoire des cellules T auto-tolérance fonctionnelle. Dans les modèles in vitro pour étudier l' engagement de la lignée de T et de développement ont permis de mieux comprendre ce processus. Cependant, ces systèmes manquent de milieu thymique complet en trois dimensions nécessaires pour le développement des lymphocytes T et, par conséquent, sont des approximations incomplètes de sélection thymique in vivo. Certains des défis liés au développement de la cellule de modélisation de T peuvent être surmontés en utilisant des modèles in situ qui fournissent un microenvironnement thymique intact qui soutient pleinement la sélection thymique de développer des cellules T. Cultures tranche organotypiques thymiques complètent existant techniques in situ. tranches thymiques préserver l'intégrité des régions corticales et médullaires thymiques et fournissent une plate-forme pour étudier le développement des thymocytes superposées d'un stade de développement défini ou de endogène T caunes dans un microenvironnement thymique matures. Compte tenu de la capacité de générer ~ 20 tranches par souris, des tranches thymiques présentent un avantage unique en termes d'évolutivité pour des expériences à haut débit. En outre, la relative facilité à générer des tranches et le potentiel thymiques de superposer différents sous-ensembles de thymiques ou d'autres populations de cellules issues de milieux divers génétiques renforce la polyvalence de cette méthode. Nous décrivons ici un protocole pour la préparation de tranches thymique, l'isolement et la superposition des thymocytes et la dissociation des tranches thymiques pour l'analyse cytométrique de flux. Ce système peut également être adapté pour étudier le développement des cellules T non conventionnelles, ainsi que de visualiser la migration des thymocytes, des interactions de cellules stromales thymocytes et des signaux associés à la sélection de TCR thymique par microscopie biphotonique.
Introduction
Les cellules T se différencient par une série d'intermédiaires du développement dans le thymus au cours de laquelle ils rencontrent plusieurs postes de contrôle qui assurent la génération d'une fonction auto-tolérance de répertoire des cellules T 03/01. La sélection positive favorise la survie des thymocytes avec des récepteurs de cellules T (TCR) capables de reconnaître, avec une faible affinité à modérée, peptide présenté par les grandes molécules complexes d'histocompatibilité (CMH) sur les cellules corticales thymiques épithéliales (cTEC) 2,3. La sélection négative et T régulatrices (T reg) le développement des cellules contribuent à la mise en place d' une auto-tolérance par l'élimination ou le détournement de thymocytes qui répondent fortement à l' auto-peptide présenté par le CMH 2,4. Immature CD4 + CD8 + double positive (DP) thymocytes exprimant des TCR qui passent le processus de sélection se différencient en sous – populations de cellules T matures, dont la majorité sont CMH de classe I restreints cytotoxiques CD8 +ou du CMH de classe II restreint (SP) des cellules T CD4 + auxiliaires simples positifs, avant de quitter le thymus pour exécuter des fonctions effectrices dans les organes lymphoïdes secondaires 1-3.
Ajoutant à la complexité du développement des cellules T est la migration dynamique et rencontres cellulaires de développement thymocytes à travers le réseau de cellules stromales 5-9. Ces cellules stromales jouent des rôles distincts dans le développement des thymocytes et sont différentiellement répartis entre les régions corticales et médullaires thymiques où positive et la sélection négative se produisent 10. Bien que la sélection positive se déroule principalement dans le cortex, il y a accumulation de preuves que thymocytes DP migrent vers la moelle et continuent d'exiger des signaux TCR avant qu'ils ne se différencient en cellules T matures suggérant que la moelle peut fournir des signaux supplémentaires nécessaires à l'achèvement de la sélection positive et de la lignée différenciation 11,12. Plus loin,malgré la présence de cellules spécialisées médullaires thymiques épithéliales (MTEC) qui expriment et présentent des antigènes tissulaires restriction facilitant la suppression des thymocytes autoréactifs 13,14, une grande partie de la sélection négative se produit dans le cortex en réponse à ubiquitaire exprimé auto-peptide présenté par dendritique cellules 15,16. Ainsi, des modèles précis de développement des cellules T doivent fournir un microenvironnement thymique très organisée, avec corticale intacte et les régions médullaires, qui facilite l'interaction entre les thymocytes et les cellules stromales, et prend en charge la migration des thymocytes que ces cellules subissent une sélection positive et négative.
Afin de compléter l' analyse ex vivo de thymocytes comme moyen d'étude de sélection positive et négative, un certain nombre d'in vitro, in situ et in vivo dans des modèles de développement des cellules T ont été développés 17-22. Il a été notoirement difficile de récapitulersélection positif in vitro, mais coculture des populations de cellules souches ou de précurseurs de cellules T avec des cellules stromales exprimant ligand Notch, notamment OP9-DL1 / 4 cellules, a la capacité de soutenir l' engagement de la lignée T et une sélection positive limitée qui en fait un précieux modèle in vitro pour étude T développement des cellules 23-25. Limitations de ce système, cependant, comprennent le fait que ces cellules manquent de machines de traitement du peptide unique qui se trouve dans les cellules stromales thymiques et le microenvironnement thymique en trois dimensions.
Bien que techniquement plus lourd, in situ et in vivo dans des modèles de sélection thymique peut surmonter certains obstacles liés aux systèmes in vitro. Cultures d'organes thymiques réagréger (RTOC) contiennent des mélanges de thymocytes et les cellules stromales thymiques 18,26,27 définies. Ces reaggregates de cellules épithéliales thymiques maintenir la classe I et II l'expression du CMH et peuvent soutenir development des deux sous-ensembles classiques de cellules T, mais manquent encore défini les structures corticales et médullaires. Culture d'organes thymique fœtal (FTOC) est un modèle populaire du développement des cellules T qui peuvent être ensemencé avec thymocytes par culture goutte pendante de lobes thymiques lymphodepleted ou par injection de thymocytes en lymphoreplete lobes thymiques et soutenir le développement efficace des CD4 + et CD8 + T cellules au fil du temps dans la culture 18,28-31. Au début de la culture des lobes thymiques fœtaux il y a un manque de mTECs, mais les structures corticales et médullaires définies peut se développer au fil du temps en fonction des conditions. Une considération importante est que ce modèle peut préférentiellement soutenir foetal contre le développement des cellules T de l'adulte. Enfin, l'injection intrathymique des précurseurs thymiques définis chez la souris adulte est techniquement difficile, mais prévoit clairement un environnement pour soutenir Développement des cellules T in vivo. Ceux – ci in situ et des modèles in vivo sont d' excellents outils de to le développement étude des lymphocytes T et leur utilisation doivent être considérés sur une base expérience par expérience.
Tranches thymiques, cependant, ont récemment émergé comme un modèle complémentaire polyvalent pour étudier la sélection thymique in situ avec la possibilité d'accueillir unique, complexe, et les expériences de débit généralement plus élevés. Tranches thymiques maintenir l'intégrité des régions corticales et médullaires et fournissent un cadre de cellules stromales qui prend en charge la migration des thymocytes au cours du développement ainsi que l' efficacité de sélection positive et négative 11,32-39. Sous – ensembles ajoutés au – dessus des tranches thymiques thymocytes migrent dans les tissus et à leur microenvironnement créneau approprié 34,37. Thymocytes superposées peuvent être distinguées des cellules endogènes de tranche thymique par des marqueurs ou des marqueurs fluorescents congéniques et peuvent être maintenues en culture pendant plusieurs jours. cultures thymique tranche organotypiques peuvent être utilisés pour étudier divers aspectsdu développement des cellules T y compris la sélection thymique, le comportement des thymocytes (migration et interactions cellulaires), et thymocytes localisation, entre autres. Etant donné la possibilité de générer ~ 20 tranches thymiques par souris, l'évolutivité des expériences est généralement supérieure à l' autre dans des modèles in situ de sélection thymique. Bien que la préparation de tranches thymiques nécessite un équipement spécialisé, comme le vibratome, et la durée de vie des tranches thymiques dans la culture est limitée en raison de la perte de cellules dans le temps par l'intermédiaire de la mort cellulaire et l'absence d'une membrane d'encapsulation, des tranches thymiques fournissent un excellent modèle pour l'analyse de la sélection thymique des populations synchronisées de thymocytes dans un microenvironnement thymique mature. Ici, nous décrivons la préparation de tranches thymiques (y compris la récolte du thymus, de l'agarose plongement de lobes du thymus et vibratome sectionnement du tissu incorporé), l'isolement et la superposition des thymocytes et la dissociation des tranches thymiques pour l'analyse cytométrique de flux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole pour la préparation des tranches thymiques et des résultats représentatifs de la sélection positive et négative efficace de superposition de pré-sélection du CMH de classe I restreints TCR thymocytes transgéniques par cytométrie en flux. Ce système a été utilisé avec un succès similaire pour soutenir la sélection positive des cellules T CD4 + CMH de classe II restriction de la pré-sélection thymocytes DP 32, et, en présence de l' antigène de l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Josée Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) and Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.
Materials
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated – T12) | Polyciences | 18986 | 22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100X | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
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