Hazırlık ve Organotipik Timik Dilim Kültürler Uygulamaları
Summary
Bu akış sitometrisi ile bir arada, T hücrelerinin gelişmekte olan pozitif ve negatif seçim modeli için kullanılabilir, timik dilimlerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Timik dilimler de timosit göç, yerelleşme yerinde analizi için uyarlanmış ve immünfloresans ve iki foton mikroskobu ile sinyal olabilir.
Abstract
Fonksiyonel, kendini hoşgörülü T hücre repertuarının nesil sonuçlanan eşsiz ve son derece organize timik mikroçevresinin timik seçim ilerler. T soy bağlılığı ve gelişimini incelemek için in vitro modeller bu süreçte değerli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu sistemler, T hücresi gelişimi için gerekli olan tam üç boyutlu timik ortam eksikliği ve bu nedenle, in vivo olarak timus seçim eksik yaklaşık değerlerdir. Modelleme T hücre gelişimi ile ilgili sorunlardan bazıları tamamen T hücrelerini gelişmekte olan timus seçimi destekleyen sağlam bir timik mikro sağlamak yerinde modellerinde kullanılarak aşılabilir. Timik dilim Organotipik kültürler in situ teknikleri mevcut tamamlayacak. Timik dilim timik kortikal ve medüller bölgelerin bütünlüğünü korumak ve tanımlanmış bir gelişim aşamasında veya endojen T c Kaplanmış timositlerin gelişimini incelemek için bir platform sağlamakolgun timik mikroçevresinin içinde arşın. fare başına ~ 20 dilim oluşturmak için yeteneği göz önüne alındığında, timik dilim yüksek verimlilik deneyler için ölçeklenebilirlik açısından benzersiz bir avantaj sunuyoruz. Dahası, farklı genetik geçmişleri farklı timik alt kümelerini ya da diğer hücre popülasyonları bindirmek için timik dilimleri ve potansiyelini üreten göreli kolaylığı bu yöntemin çok yönlülüğünü artırır. Burada timik dilimleri, izolasyon ve timositlerin kaplaması ve akış sitometrik analiz için timik dilimlerin ayrışma hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu sistem aynı zamanda timosit taşıma, timosit-stromal hücre etkileşimleri ve iki foton mikroskobu ile timik seçimi ile bağlantılı TCR sinyallerinin geleneksel olmayan T hücresi gelişimini incelemek ve görselleştirmek için adapte edilebilir.
Introduction
T hücreleri bir işlevsel, serbest-dayanıklı T hücresi repertuarının 1-3 üretimi sağlamak birçok kontrol noktaları karşılaşma, bu süre içinde timus gelişim ara bir dizi farklılık gösterir. Pozitif seçim kortikal timik epitelial hücreler (CTEC) -2,3 üzerindeki majör histokompatibilite kompleks molekülleri (MHC) tarafından sunulan, orta dereceli afınitede, peptide düşük, tanıyan T hücre reseptörleri (TCR) ile timositler hayatta kalmasını teşvik eder. Negatif seçim ve düzenleyici T (T reg) hücre gelişimi MHC 2,4 tarafından sunulan öz-peptid kuvvetle cevap timositlerin ortadan kaldırılması ya da saptırma yoluyla kendini tolerans kurulmasına katkıda bulunur. Olgunlaşmamış CD4 + CD8 + çift pozitif (DP) olgun T hücre alt içine seçim süreci geçmesi ayırt TCRler ifade timositleri, hangi MHC sınıf I kısıtlı CD8 + sitotoksik çoğunluğuveya MHC sınıf ikincil lenfoid organlara 1-3 efektör işlevleri gerçekleştirmek için timus çıkmadan önce, CD4 + yardımcı tek pozitif (SP) T hücrelerini II kısıtlı.
T hücre gelişiminin karmaşıklığı ekleme dinamik göç ve stromal hücre ağının 5-9 boyunca timositleri gelişen hücresel karşılaşır olduğunu. Bu stromal hücreler timosit gelişiminde belirgin rol oynayan ve farklı şekilde pozitif ve negatif seleksiyon 10 meydana timik kortikal ve medüller bölgeler arasında dağıtılır. Pozitif seçim öncelikle korteks yer alsa da, DP timositleri medulla göç ve medulla pozitif seçimi ve soy tamamlanması için gerekli ek sinyaller olabileceğini düşündürmektedir olgun T hücreleri içine ayırt önce TCR sinyallerini gerektirecek devam ettiğini biriken kanıtlar vardır farklılaşma 11,12. Bundan başka,reaktif timositleri 13,14 silinmesini kolaylaştırmak ifade uzman medüller timik epitelial hücreler (MTec) ve mevcut dokuya sınırlı antijenlerin varlığına rağmen, negatif seçim büyük bir kısmı her yerde bulunan bir kendinden peptit dendritik tarafından sunulan ifade yanıt olarak kortekste meydana hücreler 15,16. Böylece, T hücre gelişiminin doğru modelleri timositlerde ve stromal hücreleri arasındaki etkileşimi kolaylaştırır ve bu hücreler pozitif ve negatif seçim tabi olarak timosit göç destekler sağlam kortikal ve medüller bölgeler ile, son derece organize timik mikro sağlamalıdır.
Ex vivo olarak tamamlamak için, yerinde, pozitif ve negatif seçim in vitro bir dizi okuyan bir araç olarak timositlerin analiz eder ve T hücresi gelişiminin in vivo modellerde 17-22 geliştirilmiştir. Recapitulate etmek oldukça zor olmuşturPozitif in vitro seleksiyon, ama Notch ligandı ifade eden kök hücre popülasyonlarının veya stromal hücreler ile T hücre öncülerinin kokültürünün, özellikle OP9-DL1 / 4 hücreleri, in vitro modelde o paha biçilmez bir hale T soy bağlılığı ve sınırlı olumlu seçimi desteklemek için yeteneğine sahiptir çalışma T hücre gelişimi 23-25. Bu sistemin Sınırlamalar Bununla birlikte, bu hücreler timik stromal hücrelerinde bulunan benzersiz peptid işleme makine ve üç boyutlu timik mikro yoksun olduğu gerçeğini içerir.
Daha teknik hantal, in vitro sistemler ile ilgili bazı engelleri aşmak yerinde ve timus seçim vivo modellerde rağmen. Reaggregate timik organ kültürleri (RTOC) timositlerde ve timik stromal hücrelerin 18,26,27 karışımlarını tarif içerir. Bu timik epitel hücre Reaggregates MHC sınıf I ve II ifadesini korumak ve developme destekleyebilirnt konvansiyonel T hücre alt, ama yine de kortikal ve medüller yapıları tanımlanmıştır yoksundur. Fetal timik organ kültürü (FTOC) lymphoreplete timik loplara lymphodepleted timik lob veya timositlerin enjeksiyon yoluyla asılı bırakma kültürü ile timositler ile tohumlandı ve CD4 + ve CD8 + T etkin gelişimini desteklemek edilebilir T hücresi gelişiminin popüler bir modeldir kültür 18,28-31 zaman içinde hücre. Fetal timik lobların kültürünün başlangıcında mTECs bir yetersizlik var, ama tanımlanan kortikal ve medüller yapılar koşullara bağlı zamanla gelişebilir. Önemli bir husus, bu model, tercihan yetişkin T hücre gelişimi karşısında fetal destek olmasıdır. Son olarak, erişkin farelerde tanımlanan timik öncülerinin intrathymic enjeksiyonu teknik olarak zordur ama açıkça destekleyen bir ortam sağlar In vivo T hücresi gelişme. In situ ve in vivo modellerde Bu mükemmel araçlar t'nino çalışma T hücre gelişimi ve kullanımı bir deneme-by-deney temelinde ele alınmalıdır.
Timik dilimleri, ancak, son zamanlarda benzersiz, karmaşık ve genellikle daha yüksek verim denemeleri karşılamak için imkanı ile yerinde timik seçimi incelemek için çok yönlü, tamamlayıcı model olarak ortaya çıkmıştır. Timik dilim kortikal ve medüller bölgeler bütünlüğünü korumak ve geliştirme yanı sıra verimli pozitif ve negatif seleksiyon 11,32-39 sırasında timosit göç destekler stromal hücrelerin bir çerçeve sunmaktadır. Timik dilimleri üstünde eklenen timosit alt kümeleri dokuya ve bunların uygun microenvironmental niş 34,37 göç. üst üste timositleri konjenik işaretleri veya floresan etiketler ile timik dilim endojen hücrelerden ayırt edilebilir ve birkaç gün boyunca kültür içinde muhafaza edilebilir. Timik dilim Organotipik kültürler çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilirdiğerleri arasında timus seçimi, timosit davranışı (göç ve hücresel etkileşimleri) ve timosit lokalizasyonu da dahil olmak üzere T hücresi gelişiminin. Fare başına ~ 20 timus dilim oluşturmak için yeteneği göz önüne alındığında, deney ölçeklenebilirlik timus seçimi yerinde modellerinde diğerinden daha genel olarak daha fazladır. timik dilim hazırlanması uzman gibi vibratome gibi ekipmanları, ve hücre ölümü aracılığıyla zamanla hücre kaybı ve bir kapsül zarının olmaması nedeniyle sınırlıdır kültürde timik dilim yaşam süresi gerektirmesine rağmen, timik dilimleri mükemmel bir model sağlamak olgun timik mikroçevresinin içinde timositlerin senkronize popülasyonlarının timus seçimi analizi için. Burada akım sitometri analizi için timik dilim, izolasyon ve timositlerin bindirilirken, ve ayrışma (timus, timus lobları agaroz gömme ve gömülü doku vibratome bölümlendirilmeleri hasat dahil) timik dilimleri hazırlanmasını tarif etmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada timik dilimleri ve akış sitometrisi ile Kaplanmış ön seçim MHC sınıf I kısıtlamalı TCR transjenik timositlerin etkin pozitif ve negatif seçim için temsili sonuçlar hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu sistem, agonist antijen, negatif seçim ve timus regülatör T geliştirme 11,12 mevcudiyetinde, ön seçim DP timositleri 32 MHC sınıf II kısıtlı CD4 + T hücrelerinin pozitif seçim destek benzer başarı ile kullanılabilir, ve e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Josée Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) and Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.
Materials
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated – T12) | Polyciences | 18986 | 22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100X | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
Referências
- Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
- Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
- Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
- Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
- Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
- Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
- de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
- Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
- Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
- Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
- Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
- Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
- Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
- Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
- Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
- Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
- Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
- Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
- Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
- Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
- Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
- Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).
