Preparação e Aplicações de culturas organotípicas Tímico Fatia

Summary

Descreve-se a preparação de fatias do timo que, em combinação com a citometria de fluxo, podem ser utilizados para modelar selecção positiva e negativa do desenvolvimento de células T. Fatias do timo pode também ser adaptado para a análise in si tu de migração de timócitos, localização e a sinalização através de imunofluorescência e microscopia de dois fotões.

Abstract

Seleção rendimentos do timo em um microambiente tímico única e altamente organizada resultando na geração de um repertório de células T funcional, auto-tolerante. Modelos in vitro para estudar o compromisso linhagem T e desenvolvimento forneceram informações valiosas sobre este processo. No entanto, estes sistemas têm a meio do timo tridimensional completa necessária para o desenvolvimento da célula T e, por conseguinte, são aproximações incompletos in vivo de selecção tímica. Alguns dos desafios relacionados com o desenvolvimento de células T de modelagem pode ser superado usando em modelos in situ que fornecem um microambiente tímico intacta que apoia plenamente a seleção do timo de desenvolvimento de células T. Timo culturas fatia organotípicas complementar as técnicas in situ. fatias tímicos preservar a integridade das regiões corticais e medulares do timo e oferecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento de timócitos sobrepostas de um estágio de desenvolvimento definidas ou de endógena T cells dentro de um microambiente tímico maduro. Dada a capacidade de gerar ~ 20 fatias por rato, fatias do timo apresentar uma vantagem única em termos de escalabilidade para experimentos de alto rendimento. Além disso, a relativa facilidade na geração de fatias do timo e potencial para sobrepor diferentes subconjuntos de timo ou de outras populações de células de diversas origens genéticas aumenta a versatilidade do presente método. Descrevemos aqui um protocolo para a preparação de fatias do timo, o isolamento e a sobreposição de timócitos, e dissociação de fatias do timo para a análise de citometria de fluxo. Este sistema também pode ser adaptado para estudar o desenvolvimento de células T não-convencionais, bem como visualizar a migração de timócitos, as interacções das células de timócitos-estromal, e sinais associados com TCR selecção tímica por microscopia de dois fotões.

Introduction

As células T diferenciam por meio de uma série de intermediários de desenvolvimento no timo durante o qual eles encontram vários pontos de controlo que asseguram a geração de, um repertório de células T auto-tolerante funcional ^1-3. A selecção positiva promove a sobrevivência dos timócitos com receptores de células T (TCR), capazes de reconhecer, com baixa a moderada afinidade, péptido apresentados por moléculas de grandes complexos de histocompatibilidade (MHC) sobre as células epiteliais tímicas corticais ^(2,3 CTEC). Selecção negativa e desenvolvimento de células T reguladoras (T _reg) contribuir para o estabelecimento da auto-tolerância através da eliminação ou desvio de timócitos que respondem fortemente a auto-peptídeo apresentado por MHC ^2,4. Imaturos CD4 ⁺ CD8 ⁺ positivas dupla (DP) timócitos expressando TCRs que passam o processo de selecção diferenciam em subpopulações de células T maduras, a maioria dos quais são de classe I-restringida de MHC de células CD8 ⁺ citotóxicasou MHC de classe II restrito de células T CD4 ⁺ auxiliares individuais positivas (SP), antes de sair do timo para realizar as funções efectoras nos órgãos linfóides secundários ^1-3.

Adicionando à complexidade do desenvolvimento de células T é a migração dinâmica e encontros celulares do desenvolvimento de timócitos em toda a rede celular de estroma ^5-9. Estas células estromais desempenham papéis distintos no desenvolvimento de timócitos e são diferencialmente distribuídos entre as regiões corticais e medulares do timo, onde positivo e seleção negativa ocorrem ^10. Embora a selecção positiva ocorre principalmente no córtex, não há acumulação de provas de que os timócitos DP migrar para a medula e continuar a exigir que os sinais de TCR, antes de se diferenciar em células T maduras, sugerindo que a medula pode fornecer sinais adicionais necessários para a realização de selecção positiva e linhagem ^11,12 diferenciação. Mais distante,apesar da presença de células especializadas medulares do timo epiteliais (MTEC) que expressam e apresentam antigénios restrita a um tecido que facilitem a eliminação de timócitos autorreactivas ^13,14, uma grande proporção de selecção negativa ocorre no córtex em resposta a expresso ubiquamente auto-péptido apresentado por dendrítica células ^15,16. Assim, modelos precisos de desenvolvimento de células T deve proporcionar um microambiente tímico altamente organizada, com cortical intacta e regiões medulares, que facilita a interacção entre timócitos e células do estroma, e suporta a migração de timócitos como estas células sofrem de selecção positiva e negativa.

Para complementar ex vivo análises de timócitos como um meio de estudar a selecção positiva e negativa, um certo número de ensaios in vitro, in situ, e em modelos in vivo do desenvolvimento de células T têm sido desenvolvidos ^17-22. Tem sido notoriamente difícil de recapitulara selecção positiva, in vitro, mas co-cultura de populações de células estaminais ou precursores de células T com células estromais que expressam ligando de Notch, nomeadamente OP9-DL1 / 4 células, tem a capacidade de suportar compromisso linhagem T e selecção positivo reduzido tornando-se um valor inestimável modelo in vitro para desenvolvimento de células T estudo ^23-25. As limitações deste sistema, no entanto, incluem o facto de estas células não possuem a maquinaria de processamento de péptidos única encontrada nas células do estroma de timo e o microambiente tímico tridimensional.

Embora tecnicamente mais complicada, in situ e in vivo em modelos de selecção tímica pode superar alguns dos obstáculos relacionados com os sistemas in vitro. Culturas de órgãos tímicos Reaggregate (RTOC) contêm misturas de timócitos e de células do estroma de timo ^18,26,27 definido. Estas células epiteliais tímicas reaggregates manter a MHC de classe I e II de expressão e pode suportar development de ambos os subconjuntos de células T convencionais, mas ainda não têm definido estruturas corticais e medulares. Fetal cultura de órgão tímico (FTOC) é um modelo popular de desenvolvimento de células T que pode ser semeada com timócitos via cultura de suspensão-gota de lóbulos do timo lymphodepleted ou por meio de injecção de timócitos em lymphoreplete lóbulos do timo e apoiar o desenvolvimento eficiente de células T CD4 ⁺ e CD8 ⁺ T células ao longo do tempo na cultura ^18,28-31. No início da cultura de lobos do timo fetal há uma escassez de mTECs, mas as estruturas corticais e medulares definidos podem desenvolver ao longo do tempo, dependendo das condições. Uma consideração importante é que este modelo pode preferencialmente suportar fetal contra o desenvolvimento de células T do adulto. Finalmente, injeção intratímico de precursores do timo definidos em camundongos adultos é tecnicamente desafiador, mas claramente fornece um ambiente para apoiar Desenvolvimento de células T in vivo. Estes in situ e em modelos in vivo são excelentes ferramentas to desenvolvimento de células T estudo ea sua utilização deve ser considerada a título experimental de-by-experimento.

Fatias do timo, no entanto, surgiram recentemente como um modelo versátil, complementares para estudar a seleção do timo in situ com a possibilidade de acomodar única, complexa e experimentos de taxa de transferência, geralmente mais elevados. Fatias do timo manter a integridade das regiões corticais e medulares e fornecer um quadro de células estromais que suporta a migração de timócitos durante o desenvolvimento, bem como eficiente selecção positiva e negativa ^11,32-39. Subconjuntos de timócitos adicionados no topo de fatias do timo migram para o tecido e seu nicho microambiental adequada ^34,37. Os timócitos sobrepostas podem ser distinguidas das células endógenas fatia de timo através de marcadores cong�icas ou marcadores fluorescentes e podem ser mantidas em cultura durante vários dias. culturas organotípicas fatia do timo pode ser utilizado para estudar vários aspectosdo desenvolvimento de células T, incluindo selecção tímica, o comportamento de timócitos (migração e interacções celulares), e localização de timócitos, entre outros. Dada a capacidade de gerar ~ 20 fatias do timo por ratinho, a escalabilidade das experiências é geralmente maior do que o outro em modelos in situ de selecção tímica. Embora a preparação de fatias do timo requer equipamento especializado, tal como o vibratome, e o tempo de vida de fatias do timo em cultura é limitada devido à perda de células ao longo do tempo através de morte celular e a ausência de uma membrana de encapsulação, as fatias do timo fornecer um excelente modelo por análise de selecção tímica de populações sincronizadas de timócitos dentro de um microambiente tímico madura. Aqui, descrevemos a preparação de fatias do timo, incluindo a colheita (o timo, a incorporação de agarose de lóbulos do timo e vibratome seccionamento do tecido embebido), isolamento e revestimento dos timócitos, e dissociação de fatias do timo para a análise de citometria de fluxo.

Protocol

Protocolos para todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Terapia animal no Centro de recherche – Hôpital Maisonneuve-Rosemont. 1. colheita mouse Thymus para Preparação de tímicos Slices e suspensões de células individuais Eutanásia do rato com CO 2, seguida por deslocação cervical. Em uma capela de fluxo laminar, pin lado o rato ventral-se a uma placa de dissecação. Pulverizar o rato com 70% de etanol. Remova qualquer excesso de álcool, esfregando c…

Representative Results

análise de suporte fatias do timo dos diferentes aspectos do desenvolvimento de células T, tais como selecção positiva e negativa. Para as experiências bem sucedidas, a qualidade da fatia tímico é primordial. Deste modo, as fatias do timo deve ser examinado para assegurar a integridade do tecido tímico e que a agarose em torno do timo fatia está intacto (Figura 1A). A tensão superficial pode ser comprometida quando a agarose é danificado cau…

Discussion

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de fatias do timo e resultados representativos de selecção positiva e negativa eficiente da pré-selecção do coberto MHC classe restrita-I TCR timócitos transgênicas por citometria de fluxo. Este sistema tem sido utilizado com sucesso similar para suportar a selecção positiva de células MHC de classe II restringidas CD4 ⁺ T a partir de pré-selecção DP timócitos ^32, e, na presença do antigénio com o agonista, a selecção negativa…

Materials

Vibratome	Leica Biosystems	VT1000S
NuSieve GTG Agarose	Lonza	50080	Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated – T12)	Polyciences	18986	22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm
Double Edge Prep Blades	Personna	74-0002
Tissue Adhesive	3M	1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts	BD Falcon	353090	Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher	21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine	Wisent	350-000-CL
Fetal Bovine Serum	Wisent	080-110	Heat inactivated
L-Glutamine, 200mM	Wisent	609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100X	Wisent	450-201-EL
2-Mercaptoethanol	Alfa Aesar	A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders	Wheaton	357426
Nylon Mesh Filter	Component Supply	U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle	Bel-Art	F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer	BD Falcon	352340
Forceps Inox Tip	Dumont	RS-5047	Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm
Micro Forceps	Dumont	RS-5090