प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) और ताजा और जमे हुए चूहा मस्तिष्क के ऊतकों से Fos व्यक्त न्यूरॉन्स की जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण
Summary
यहाँ हम दोनों ताजा और जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों से neuronal टुकड़ियों Fos-व्यक्त करने में आणविक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) प्रोटोकॉल उपस्थित थे। जमे हुए ऊतक के उपयोग मूल्यवान पशु विषयों के उपयोग को अधिकतम करने के लिए कई सत्रों में कई मस्तिष्क क्षेत्रों की FACS अलगाव की अनुमति देता है।
Abstract
neuroplasticity और सीखा व्यवहार में आणविक परिवर्तन के अध्ययन के पूरे मस्तिष्क क्षेत्रों के अध्ययन से न्यूरोनल टुकड़ियों कि संघों सीखा मध्यस्थता बुलाया कम वितरित सक्रिय न्यूरॉन्स के विशिष्ट सेट का अध्ययन करने के लिए स्विच कर रहा है। प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) ने हाल ही में वयस्क चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों के लिए अनुकूलित और अनुमति न्यूरोनल मार्कर NeuN और Fos प्रोटीन, दृढ़ता से सक्रिय न्यूरॉन्स की एक मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर सक्रिय न्यूरॉन्स के अलगाव की गई है। अब तक, Fos व्यक्त न्यूरॉन्स और अन्य प्रकार की कोशिकाओं ताजा ऊतक, जो लंबे समय प्रसंस्करण दिन और मस्तिष्क के नमूनों की अनुमति बहुत सीमित संख्या लंबा और जटिल व्यवहार प्रक्रियाओं के बाद मूल्यांकन किया जाना entailed से अलग थे। यहाँ हमने पाया है कि Fos व्यक्त पृष्ठीय स्ट्रिएटम से न्यूरॉन्स और Fos mRNA की पैदावार हौसले से विच्छेदित ऊतक और ऊतक 3 के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए के बीच इसी तरह के थे – 21 दिनों के लिए। इसके अलावा, हम phenotype की पुष्टि कीन्यूरोनल का आकलन करने के जीन अभिव्यक्ति (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) और microgial (Iba1) मार्कर, जो इंगित करता है कि जमे हुए ऊतक भी की FACS अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता द्वारा NeuN पॉजिटिव और नेगेटिव NeuN हल कोशिकाओं की glial सेल प्रकार के। कुल मिलाकर, यह इकट्ठा काटना और कई FACS सत्र के लिए मस्तिष्क के ऊतकों फ्रीज करने के लिए संभव है। इस बहुमूल्य पशु विषयों है कि अक्सर लंबी और जटिल व्यवहार प्रक्रिया से गुजरा है से प्राप्त आंकड़ों की राशि अधिकतम हो।
Introduction
सीखने के दौरान, जानवरों के अति विशिष्ट उत्तेजनाओं के जटिल सेट के बीच संगठन बनाते हैं। यह उच्च संकल्प जानकारी न्यूरोनल टुकड़ियों को बुलाया कम वितरित न्यूरॉन्स की विशिष्ट पैटर्न के भीतर परिवर्तन द्वारा इनकोडिंग होने लगा है। Neuronal टुकड़ियों कि हाल ही में दृढ़ता से व्यवहार या क्यू प्रदर्शन के दौरान सक्रिय थे ऐसे Fos, चाप, और Zif268 और न्यूरॉन्स में उनके प्रोटीन उत्पादों के रूप में तुरंत जल्दी जीन (IEGs) की प्रेरण द्वारा की पहचान की है। Fos व्यक्त न्यूरॉन्स विशेष रूप से संदर्भ और क्यू-विशिष्ट सीखा व्यवहार 1-4 में कारण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, इन सक्रिय Fos व्यक्त न्यूरॉन्स के भीतर अद्वितीय आणविक neuroadaptations तंत्रिका तंत्र है कि इस तरह की लत और सदमे के बाद तनाव विकार (पीटीएसडी) 5 के रूप में सामान्य और असामान्य सीखने सीखने विकारों के दौरान गठित संघों, सीखा सांकेतिक शब्दों के लिए शीर्ष उम्मीदवार हैं।
FluoreScence सक्रिय सेल छंटनी (FACS) ने हाल ही में Fos व्यक्त न्यूरॉन्स के भीतर अद्वितीय आणविक neuroadaptations के विश्लेषण की अनुमति दी है। प्रवाह cytometry और सेल छंटनी उनके प्रकाश बिखरने और immunofluorescent विशेषताओं के अनुसार विशेषताएँ और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1960 के दशक में विकसित किए गए 6.7, और लंबे समय इम्यूनोलॉजी और कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि प्रवाह cytometry और FACS अलग एकल कक्षों है कि वयस्क मस्तिष्क के ऊतकों से प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो जाता है की आवश्यकता है। FACS पहले अलग और विश्लेषण हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए ट्रांसजेनिक चूहों कि एंटीबॉडी लेबलिंग 8,9 आवश्यकता नहीं किया था से स्ट्रिआटल न्यूरॉन्स -expressing इस्तेमाल किया गया था। हम एक एंटीबॉडी आधारित FACS विधि 10 अलग और Fos व्यक्त जंगली प्रकार के पशुओं 11-15 में दवा और / या संकेतों द्वारा सक्रिय न्यूरॉन्स में आणविक परिवर्तन का आकलन करने के लिए विकसित की है। इस विधि में, न्यूरॉन्स, सामान्य न्यूरोनल मार्कर NeuN के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ चिह्नित कर रहे हैं, जबकि दृढ़ता से सक्रिय न्यूरॉन्सFos के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैं। हालांकि हमारी प्रारंभिक विधि आवश्यक ताजा ऊतक के लिए नमूना प्रति अप करने के लिए 10 चूहों की पूलिंग, प्रोटोकॉल के बाद संशोधनों एक भी चूहा 13-15 से Fos व्यक्त न्यूरॉन्स और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) असतत मस्तिष्क क्षेत्रों के विश्लेषण के FACS अलगाव की अनुमति दी । कुल मिलाकर, अद्वितीय आणविक परिवर्तन Fos व्यक्त की लत अनुसंधान 12,14,15 में संदर्भ-क्यू और सक्रिय व्यवहार की एक किस्म के दौरान सक्रिय न्यूरॉन्स में पाए गए।
ताजा ऊतक पर FACS प्रदर्शन के साथ एक प्रमुख सैन्य समस्या यह है कि यह एक पूरा दिन लग जाते हैं ऊतक और प्रक्रिया FACS द्वारा अलग कर देना है। इसके अलावा, के बारे में केवल चार नमूने प्रति दिन संसाधित किया जा सकता है। यह आम तौर पर मतलब है कि केवल एक मस्तिष्क क्षेत्र प्रत्येक मस्तिष्क से मूल्यांकन किया जा सकता है और शेष मस्तिष्क क्षेत्रों खारिज किया जाना है। इस तरह के आत्म प्रशासन और विलुप्त होने ट्राई के रूप में कम throughput व्यवहार प्रक्रियाओं के लिए एक बड़ी समस्या हैनिंग कि सर्जरी और गहन प्रशिक्षण के कई सप्ताह की आवश्यकता है। इसके अलावा, परीक्षण के दिन पर लंबी और जटिल व्यवहार प्रक्रिया यह मुश्किल ही दिन पर FACS प्रदर्शन करने के लिए बनाता है। यह एक महत्वपूर्ण लाभ जानवरों तुरंत व्यवहार परीक्षण के बाद से दिमाग को फ्रीज करने में सक्षम हो सकता है, और उसके बाद 'जांचकर्ताओं को चुनने के अलग अलग समय पर एक या एक से अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों से Fos व्यक्त न्यूरॉन्स अलग।
यहाँ हम यह है कि हमारे FACS प्रोटोकॉल दोनों ताजा और जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों से Fos व्यक्त न्यूरॉन्स (और अन्य प्रकार की कोशिकाओं) को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदर्शित करता है। एक उदाहरण के रूप में, हम Fos व्यक्त तीव्र methamphetamine इंजेक्शन के बाद और बिना इंजेक्शन (नियंत्रण हालत) भोले चूहों से चूहे स्ट्रिएटम से न्यूरॉन्स को अलग किया। हालांकि, इस FACS प्रोटोकॉल किसी भी व्यवहार या औषधीय उपचार के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे नमूने के बाद qPCR विश्लेषण से संकेत दिया है कि इन प्रकार की कोशिकाओं से जीन अभिव्यक्ति सिमी के साथ मूल्यांकन किया जा सकता हैदोनों ताजा और जमे हुए ऊतकों से LAR दक्षता।
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS तो ताजा या फ्रोजन वयस्क के मस्तिष्क के ऊतकों से न्यूरॉन्स और अन्य प्रकार की कोशिकाओं से हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, जमे हुए ऊतक का उपयोग करने की क्षमता …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.
Materials
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A' in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution' in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
Referências
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
- Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
- Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
- Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. Spectrophotometric cell sorter. Science. 156, 1364-1365 (1967).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
- Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
- Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
- US National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
- Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
- Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
- Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).
