Fluorescence Activated di separazione delle cellule (FACS) e Gene Expression Analisi di Fos-esprimono neuroni da freschi e congelati Rat tessuto cerebrale
Summary
Qui vi presentiamo una Sorting (FACS) protocollo Fluorescence Activated cellulare per studiare le alterazioni molecolari a Fos-esprimendo ensemble neuronali dal tessuto cerebrale sia freschi che surgelati. L'uso di tessuti congelati permette FACS isolamento di molte aree cerebrali in più sessioni per massimizzare l'uso di soggetti animali preziosi.
Abstract
Lo studio della neuroplasticità e alterazioni molecolari in comportamenti appresi sta passando dallo studio di regioni cerebrali intere allo studio di specifici gruppi di neuroni attivati scarsamente distribuiti chiamati complessi neuronali che mediano imparato associazioni. La fluorescenza delle cellule Attivato ordinamento (FACS) è stato recentemente ottimizzato per tessuti adulti cervello di ratto e ha permesso l'isolamento dei neuroni attivati utilizzando anticorpi contro il marcatore neuronale NeuN e proteine Fos, un marker di neuroni fortemente attivati. Fino ad ora, i neuroni Fos-esprimere e altri tipi di cellule sono state isolate dal tessuto fresco, che ha comportato lunghi giorni di lavorazione e consentite un numero molto limitato di campioni di cervello per essere valutati dopo le procedure comportamentali lunghe e complesse. Qui abbiamo trovato che i rendimenti di Fos-esprimendo neuroni e Fos mRNA da dorsale striato sono stati simili tra tessuto fresco sezionato e tessuti congelati a -80 ° C per 3 – 21 giorni. Inoltre, abbiamo confermato il fenotipodelle cellule NeuN-positivi e NeuN-negativi ordinate per valutare l'espressione genica di neuronale (NeuN), astrociti (GFAP), oligodendrocitario (Oligo2) e microgial marcatori (Iba1), il che indica che il tessuto congelato può essere utilizzato anche per FACS isolamento tipi di cellule gliali. In generale, è possibile raccogliere, analizzare e congelare il tessuto cerebrale per le sessioni multiple FACS. Questo massimizza la quantità di dati ottenuti da soggetti animali importanti che sono spesso sottoposti a procedure comportamentali lunghe e complesse.
Introduction
Durante l'apprendimento, gli animali formano associazioni tra insiemi complessi di stimoli altamente specifici. Queste informazioni ad alta risoluzione è pensato per essere codificato da alterazioni all'interno di modelli specifici di neuroni scarsamente distribuiti chiamati complessi neuronali. Ensemble neuronali sono stati recentemente identificati dalla induzione di immediatamente primi geni (IEGs) come Fos, Arco, e Zif268 e dei loro prodotti proteici nei neuroni che sono stati fortemente attivati durante il comportamento o l'esposizione stecca. Fos-esprimendo neuroni, in particolare, hanno dimostrato di giocare un ruolo causale nel contesto e comportamenti appresi 1-4 specifici stecca. Così, neuroadaptations molecolari unici all'interno di questi neuroni Fos-esprimono attivati sono migliori candidati per i meccanismi neurali che codificano apprese le associazioni costituite durante il normale disturbi di apprendimento e di formazione anomala, come la dipendenza e disturbi da stress post-traumatico (PTSD) 5.
Fluorescence attivato cell sorting (FACS) ha recentemente permesso l'analisi di neuroadaptations molecolari unici all'interno dei neuroni Fos-esprimono. Citometria a flusso e cell sorting sono stati sviluppati nel 1960 6,7 per caratterizzare e isolare le cellule in base alle loro caratteristiche di luce-dispersione e immunofluorescenza, e sono da tempo utilizzati in immunologia e la ricerca sul cancro. Tuttavia citometria a flusso e FACS richiede singole cellule dissociate che sono difficili da ottenere da tessuto cerebrale adulta. FACS è stato usato per la prima per isolare e analizzare Green Fluorescent Protein (GFP) esprimente neuroni striatali dei topi transgenici che non richiedono l'etichettatura degli anticorpi 8,9. Abbiamo sviluppato un metodo FACS a base di anticorpi 10 per isolare e valutare le alterazioni molecolari a Fos-esprimendo neuroni attivati da farmaci e / o spunti in animali wild-type 11-15. In questo metodo, i neuroni sono etichettati con un anticorpo contro il marcatore neuronale generale NeuN, mentre i neuroni iperattivazionesono etichettati con un anticorpo contro Fos. Anche se il nostro metodo iniziale richiesto messa in comune di un massimo di 10 ratti per campione di tessuto fresco, successive modifiche del protocollo ha permesso FACS isolamento di Fos-esprimendo neuroni e della polimerasi quantitativa Chain Reaction (qPCR) analisi delle aree cerebrali distinte da un singolo topo 13-15 . Nel complesso, alterazioni molecolari unici sono stati trovati in Fos-esprimendo neuroni attivati nel corso di una serie di comportamenti al contesto e cue-attivati nella ricerca dipendenza 12,14,15.
Un importante problema logistico con l'esecuzione di FACS sul tessuto fresco è che ci vuole un giorno intero per dissociare il tessuto e il processo da FACS. Inoltre, solo circa quattro campioni possono essere processati al giorno. Questo di solito significa che solo una zona del cervello può essere valutata da ciascun cervello e le zone del cervello rimanenti devono essere scartati. Questo è un grave problema per le procedure comportamentali basso throughput come l'auto-somministrazione e l'estinzione training che richiede un intervento chirurgico e molte settimane di allenamento intensivo. Inoltre, le procedure comportamentali lunghe e complicate giornata di test rende difficile eseguire FACS lo stesso giorno. Sarebbe un vantaggio significativo per essere in grado di congelare il cervello dagli animali subito dopo test comportamentali, e quindi isolare i neuroni Fos-esprimono da una o più aree cerebrali in diversi momenti della scelta degli investigatori.
Qui dimostriamo che il nostro protocollo FACS può essere utilizzato per isolare i neuroni Fos-esprimono (e altri tipi di cellule) dal tessuto cerebrale sia freschi che surgelati. A titolo di esempio, abbiamo isolato Fos-esprimendo neuroni da striato di ratto dopo le iniezioni di metanfetamina acute e da ratti naive senza iniezioni (condizione di controllo). Tuttavia, questo protocollo FACS può essere utilizzato dopo ogni trattamento comportamentale o farmacologica. La successiva analisi qPCR dei nostri campioni indicato che l'espressione del gene da questi tipi di cellule potrebbe essere valutata con Simiefficienza lar da tessuti sia freschi che surgelati.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS possono essere utilizzati per ordinare neuroni e altri tipi di cellule provenienti da tessuti adulti o cerebrale fresco o congelato. Come accennato nell'introduzione, la possibilità di utilizzare tessuti congelati consente un utilizzo ottimale di campioni da animali che sono stati sottoposti a procedure comportamentali complesse e prolungate, quali studi di auto-amministrazione e di ricaduta nella ricerca tossicodipendenza. Queste procedure comportamentali richiede solitamente 1-2 ore o più a lungo, e richied…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.
Materials
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A' in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution' in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
Referências
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