Fluorescência de células activadas (FACS) e Gene Análise da expressão de Fos-expressando neurônios de fresco e congelado cérebro de um rato Tissue
Summary
Aqui apresentamos um protocolo de fluorescência de células activadas (FACS) para estudar alterações moleculares em Fos-expressando conjuntos neuronais a partir de tecido cerebral fresco e congelado. O uso de tecido congelado permite o isolamento FACS de muitas áreas do cérebro mais várias sessões para maximizar o uso de indivíduos animais valiosos.
Abstract
O estudo da neuroplasticidade e alterações moleculares em comportamentos aprendidos está a mudar a partir do estudo de regiões do cérebro inteiro ao estudo de conjuntos específicos de neurônios ativados escassamente distribuídos chamados conjuntos neuronais que medeiam aprendidas associações. Fluorescência de células activadas (FACS) foi recentemente optimizada para o tecido do cérebro do rato adulto e permitiu o isolamento de neurónios activados utilizando anticorpos contra o marcador neuronal NeuN e proteínas Fos, um marcador de neurónios fortemente activado. Até agora, os neurónios que expressam-Fos e outros tipos de células foram isoladas a partir de tecido fresco, o que implicou dias longos de processamento e permitiu número muito limitado de amostras de cérebro de ser avaliadas após procedimentos comportamentais longas e complexas. Aqui descobrimos que os rendimentos de Fos-expressando neurônios e mRNA Fos de striatum dorsal foram semelhantes entre o tecido recém-dissecados e tecido congelado a -80 ºC durante 3 – 21 dias. Além disso, confirmou o fenótipodas células NeuN positivos e NeuN-negativas classificados por expressão avaliar gene de natureza neuronal (NeuN), astrócitos (GFAP), oligodendrocíticos (Oligo2) e microgial marcadores (Iba1), o que indica que o tecido congelado pode também ser utilizado para o isolamento de FACS de tipos de células gliais. Em geral, é possível recolher, dissecar e congelar o tecido cerebral para sessões múltiplas de FACS. Isto maximiza a quantidade de dados obtidos a partir de sujeitos animais valiosos que têm muitas vezes sido submetidos a procedimentos comportamentais longos e complexos.
Introduction
Durante o aprendizado, os animais formam associações entre conjuntos complexos de estímulos altamente específicos. Esta informação de alta resolução é pensado para ser codificado por alterações dentro dos padrões específicos de neurônios escassamente distribuídos chamados conjuntos neuronais. Conjuntos neuronais foram recentemente identificados pela indução de genes imediatamente precoces (IEGs), tais como Fos, arco, e Zif268 e seus produtos proteicos em neurónios que foram fortemente activadas durante o comportamento ou a exposição a estímulos. Fos-expressando neurônios, em particular, têm sido mostrados para desempenhar papéis causais no contexto e comportamentos aprendidos 1-4 específico-cue. Assim, neuroadaptações moleculares únicas dentro desses neurônios Fos-expressando ativados são os melhores candidatos para os mecanismos neurais que codificam aprendidas associações formadas durante distúrbios de aprendizagem e de aprendizagem anormal normais, tais como vício e transtorno de estresse pós-traumático (PTSD) 5.
fluoréscence de células activadas (FACS) permitiu recentemente a análise de neuroadaptações moleculares únicas dentro dos neurônios Fos-expressam. A citometria de fluxo e classificação celular foram desenvolvidos na década de 1960 para 6,7 caracterizar e isolar as células de acordo com as suas características de dispersão de luz e de imunofluorescência, e têm sido muito utilizados em imunologia e na investigação do cancro. No entanto citometria de fluxo e FACS requer células individuais dissociadas que são difíceis de obter a partir de tecido do cérebro adulto. FACS foi usado pela primeira vez para isolar e analisar Green Fluorescent Protein (GFP) -expressing neurónios do estriado de ratos transgénicos que não exigem rotulagem anticorpo 8,9. Foi desenvolvido um método de FACS baseada em anticorpos 10 para isolar e avaliar alterações moleculares em Fos-expressando neurónios activados por droga e / ou sinais do tipo em animais selvagens 11-15. Neste método, os neurónios são marcadas com um anticorpo contra o marcador neuronal geral NeuN, enquanto que os neurónios fortemente activadosão marcadas com um anticorpo contra Fos. Embora o nosso método inicial necessário o agrupamento de até 10 ratos por amostra de tecido fresco, modificações posteriores do protocolo permitiu o isolamento FACS de Fos-expressando neurônios e Polymerase Chain Reaction quantitativa de análise (qPCR) de áreas cerebrais distintas de um único rato 13-15 . No geral, as alterações moleculares únicas foram encontrados em Fos-expressando neurônios ativados durante uma variedade de comportamentos ao contexto e ativada por sinalização em pesquisa vício 12,14,15.
Um grande problema logístico com a realização de FACS em tecido fresco é que leva um dia inteiro para dissociar o tecido e processo pelo FACS. Além disso, apenas cerca de quatro amostras pode ser processado por dia. Isto normalmente significa que apenas uma área do cérebro pode ser avaliado a partir de todos os cérebros e os restantes áreas do cérebro têm que ser descartados. Este é um grande problema para os procedimentos comportamentais baixo rendimento como a auto-administração e trai extinçãoning que requer cirurgia e muitas semanas de treinamento intensivo. Além disso, os procedimentos comportamentais longas e complicadas no dia do teste faz com que seja difícil de executar de FACS no mesmo dia. Seria uma vantagem significativa de ser capaz de congelar os cérebros dos animais imediatamente após o teste de comportamento, e, em seguida, isolar-Fos neurónios que expressam a partir de uma ou mais áreas do cérebro em momentos diferentes da escolha do investigador.
Aqui demonstramos que o protocolo de FACS pode ser usado para isolar neurónios Fos-expressam (e outros tipos de células) a partir de tecido cerebral, tanto frescos e congelados. Como um exemplo, nós isolamos neurônios do corpo estriado de ratos após as injeções de metanfetamina agudas e de ratos ingênuos, sem injeções (condição de controle) Fos-expressar. No entanto, este protocolo FACS pode ser usado após qualquer tratamento comportamental ou farmacológica. análise qPCR subsequente de nossas amostras indicaram que a expressão do gene a partir desses tipos de células pode ser avaliada com simieficiência lar a partir de tecido fresco e congelado.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS pode ser usado para classificar os neurónios e outro tipo de células a partir de qualquer tecido cerebral adulto fresca ou congelada. Como mencionado na introdução, a capacidade de usar tecido congelado permite uma utilização óptima das amostras de animais que tenham sido submetidos a procedimentos comportamentais complexas e prolongadas, como a auto-administração e de recaída estudos em pesquisa vício. Estes procedimentos comportamentais geralmente leva 1-2 horas ou mais tempo, e necessitam de todos os …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.
Materials
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A' in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution' in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
Referências
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