蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）と生鮮・冷凍ラット脳組織からのFos発現ニューロンの遺伝子発現解析
Summary
ここでは、生鮮・冷凍の両方の脳組織から神経アンサンブルをフォスが発現に分子変化を研究するための蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）プロトコルを提示します。凍結組織の使用は、貴重な動物被験体の使用を最大化するために、複数のセッションに比べて多くの脳領域のFACS単離を可能にします。
Abstract
神経可塑性と学習された行動の分子変化の研究は関連を学んだ媒介する神経のアンサンブルと呼ばれるまばらに分布し、活性化ニューロンの特定のセットの研究に全脳領域の研究からスイッチングされます。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、最近、成体ラット脳組織のために最適化し、ニューロンマーカーのNeuN及びFos蛋白質、強く活性化されたニューロンのマーカーに対する抗体を用いて活性化ニューロンの単離を可能にされています。今までは、Fosの発現ニューロンおよび他の細胞タイプは、長い処理日と長く複雑な行動手順後に評価される脳サンプルの許可非常に限られた数を伴う新鮮な組織から単離しました。 21日- 。ここでは、背側線条体からのFos発現ニューロンとのFos mRNAの収率は3 -80ºCで凍結したばかりの解剖組織と組織との間に類似していたことがわかりました加えて、我々は表現型を確認しました凍結組織はまたのFACS単離に使用することができることを示している神経細胞の評価遺伝子発現（ のNeuN）、アストロサイト（GFAP）、オリゴデンドロサイト（Oligo2）とmicrogial（IBA1）マーカーによるのNeuN陽性とのNeuN陰性選別細胞のグリア細胞型。全体的に、収集解剖複数FACSセッションの脳組織を凍結することが可能です。これは、多くの場合、長くて複雑な行動手順を受けた貴重な動物被験体から得られたデータの量を最大化します。
Introduction
学習の間、動物は非常に特定の刺激の複雑なセット間の関連付けを形成します。この高解像度情報は、神経アンサンブル呼ばまばらに分布したニューロンの特定のパターン内の変化によってエンコードされると考えられています。ニューロンアンサンブルは最近強く行動やキュー露光時に活性化したようなフォス 、 アーク 、およびニューロンにおけるのZif268およびそのタンパク質産物として直ちに初期遺伝子（IEGs）の誘導により同定されています。特に、フォス発現ニューロンは、コンテキストに因果役割を果たしていることが示されており、キュー固有の行動1-4を学びました。したがって、これらの活性化フォス発現ニューロン内でユニークな分子神経適応は、エンコードは、このような中毒や心的外傷後ストレス障害（PTSD）5などの通常の学習および異常な学習障害、中に形成された関連を学んだ神経機構のトップ候補です。
Fluorescence活性化細胞選別（FACS）は、最近のFos発現ニューロン内で一意の分子神経適応の分析を可能にしました。フローサイトメトリーおよび細胞分取、その光散乱および免疫蛍光特性に応じて細胞を特徴付けるし、単離するために6,7、1960年代に開発された、と長い免疫学および癌研究に使用されています。しかし、フローサイトメトリーおよびFACSは、成人の脳組織から得ることが困難で解離した単一細胞を必要とします。 FACSは、第一の抗体標識8,9を必要としなかったトランスジェニックマウスからの線条体ニューロンを発現性緑色蛍光タンパク質（GFP）を単離し、分析しました。私たちは、薬物および/ または野生型動物における手がかり11-15によって活性化フォス発現ニューロンに分子変化を分離し、評価するために、抗体ベースのFACS法10を開発しました。強くニューロンを活性化しながら、この方法では、ニューロンは、一般的なニューロンのマーカーのNeuNに対する抗体で標識されていますFosタンパク質に対する抗体で標識されています。新鮮な組織のためのサンプルあたり最大10匹のラットの私たちの最初の方式に必要なプーリングが、プロトコルのその後の修正はフォス発現ニューロンのFACS分離し、単一のラット13-15から離散脳領域の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）分析を可能にしました。全体的に、ユニークな分子変化は、中毒の研究12,14,15でcontext-とキュー活性化のさまざまな動作中に活性化フォス発現ニューロンで発見されました。
新鮮な組織にFACSを実行すると、主要な物流の問題は、FACSによる組織とプロセスを分離するために1丸一日かかることです。また、わずか約4つのサンプルは、日ごとに処理することができます。これは通常、唯一の脳領域は、各脳から評価することができ、残りの脳の領域が廃棄されなければならないことを意味します。これは、自己投与及び絶滅TRAIのような低スループットの行動手順のための主要な問題です手術や集中的な訓練の数週間を必要と寧。また、試験日に長く複雑な行動手順は難しい同じ日にFACSを行うことができます。直ちに行動試験後、動物から脳を凍結し、その後の研究者」が選択した異なる時点で一つ以上の脳領域からのFos発現ニューロンを単離できることが大きな利点であろう。
ここで我々はFACSプロトコルは新鮮凍結両方脳組織からのFos発現ニューロン（および他の細胞型）を単離することができることを示しています。例として、我々は急性メタンフェタミン注射後の注射なしナイーブラット（対照条件）から、ラットの線条体からのFos発現ニューロンを単離しました。しかしながら、このFACSプロトコルは任意の行動または薬理学的処置の後に使用することができます。我々のサンプルのその後のqPCR分析は、これらの細胞型からの遺伝子発現は、シミを用いて評価することができることが示され生鮮・冷凍の両方の組織からLAR効率。
Protocol
Representative Results
Discussion
FACSは、新鮮または凍結のいずれか成体脳組織からニューロンおよび他の細胞タイプを分類するために使用することができます。冒頭で述べたように、凍結組織を使用する能力は、そのような中毒研究における自己投与および再発の研究など、複雑かつ長期化行動の手順を、受けた動物からのサンプルの最適な利用を可能にします。 2時間以上、およびすべての動物が必要です-これらの行動?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.
Materials
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A' in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution' in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
Referências
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
- Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
- Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
- Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. Spectrophotometric cell sorter. Science. 156, 1364-1365 (1967).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
- Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
- Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
- US National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
- Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
- Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
- Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).
