Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och Gene Expression Analys av Fos-uttryckande nervceller från färsk och fryst Rat hjärnvävnad
Summary
Här presenterar vi en fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) protokoll för att studera molekylära förändringar i Fos-uttryckande neuronala ensembler från både färsk och fryst hjärnvävnad. Användningen av fryst vävnad kan FACS isolering av många områden i hjärnan över flera sessioner för att maximera användningen av värdefulla djur.
Abstract
Studiet av neuroplasticitet och molekylära förändringar i inlärda beteenden byter från studien av hela hjärnregioner till studiet av specifika uppsättningar av glest fördelade aktiverade neuroner som kallas neuronala ensembler som förmedlar inlärda associationer. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) har nyligen optimerats för vuxen råtta hjärnvävnad och tillät isolering av aktiverade neuroner med användning av antikroppar mot den neuronala markören Neun och Fos-protein, en markör av starkt aktiverade neuroner. Hittills har Fos-uttryckande nervceller och andra celltyper som isolerats från frisk vävnad, vilket innebar långa behandlingsdagar och får mycket begränsat antal av hjärnprover som ska bedömas efter långa och komplicerade beteende förfaranden. Här fann vi att utbyten av Fos-uttryckande neuroner och Fos-mRNA från dorsala striatum liknade mellan nyligen dissekeras vävnad och vävnad frystes vid -80 ° C under 3 – 21 dagar. Dessutom bekräftade vi fenotypenav NeuN-positiva och NeuN negativa sorterade celler genom att bedöma genexpression av neuronal (NeuN), astrocytisk (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) och microgial (Iba1) markörer, vilket tyder på att fryst vävnad också kan användas för FACS isolering av gliala celltyper. Totalt sett är det möjligt att samla in, analysera och frysa hjärnvävnad för flera FACS sessioner. Detta maximerar mängden data som erhållits från värdefulla djurindivider som ofta har genomgått långa och komplexa beteende förfaranden.
Introduction
Under inlärning, djur bilda föreningar mellan komplexa uppsättningar av mycket specifika stimuli. Denna höga upplösning informationen tros kodas av förändringar inom specifika mönster av glest fördelade nervceller kallade neuronala ensembler. Neuronala ensembler har nyligen identifierats genom induktion av omedelbart tidiga generna (IEGS) såsom Fos, Arc, och Zif268 och deras proteinprodukter i nervceller som var starkt aktiveras under uppförande eller cue exponering. Fos-uttryckande neuroner i synnerhet har visat sig spela kausala roller i sitt sammanhang och cue specifika inlärda beteenden 1-4. Således, unika molekylära neuroadaptations inom dessa aktiverade Fos-uttryckande nervceller är toppkandidater för neurala mekanismer som kodar lärt sammanslutningar under normala lärande och onormal inlärningsstörningar, såsom missbruk och posttraumatiskt stressyndrom (PTSD) 5.
Fluorescence aktiverad cellsortering (FACS) har nyligen tillåtit analys av unika molekylära neuroadaptations inom Fos-uttryckande neuroner. Flödescytometri och cellsortering utvecklades på 1960-talet 6,7 för att karakterisera och isolera celler enligt deras ljusspridande och immunofluorescenta egenskaper och har länge använts inom immunologi och cancerforskning. Dock flödescytometri och FACS kräver dissocierade enkla celler som är svåra att erhålla från adult hjärnvävnad. FACS användes först för att isolera och analysera grönt fluorescerande protein (GFP) uttryckande striatala neuroner från transgena möss som inte kräver märkning antikropp 8,9. Vi utvecklade ett antikroppsbaserad FACS-metoden 10 för att isolera och utvärdera molekylära förändringar i Fos-uttryckande nervceller aktiveras av läkemedel och / eller signaler i vild typ djur 11-15. I denna metod är neuroner märkta med en antikropp mot den allmänna neuronal markör Neun, medan kraftigt aktiverat nervcellerär märkta med en antikropp mot Fos. Även om våra initiala metod krävs sammanslagning av upp till 10 råttor per prov för färsk vävnad, senare ändringar i protokollet tillåts FACS isolering av Fos-uttryckande neuroner och kvantitativ Polymerase Chain Reaction (qPCR) analys av diskreta områden i hjärnan från en enda råtta 13-15 . Sammantaget var unika molekylära förändringar hittades i Fos-uttryckande nervceller aktiveras under en mängd av kontext- och cue-aktiverade beteenden i missbruk forskning 12,14,15.
En stor logistisk problem med att utföra FACS på färsk vävnad är att det tar en hel dag att dissociera vävnaden och processen genom FACS. Dessutom kan endast cirka fyra prover behandlas per dag. Detta innebär vanligtvis att endast en hjärna område kan bedömas från varje hjärna och de återstående hjärnområden måste kasseras. Detta är ett stort problem för låg genomströmning beteende procedurer såsom självadministrering och utrotning utbildning som kräver kirurgi och många veckors intensiv träning. Dessutom långa och komplicerade beteende förfaranden för testdag gör det svårt att utföra FACS på samma dag. Det skulle vara en stor fördel att kunna frysa hjärnor från djuren omedelbart efter beteendetestning, och sedan isolera Fos-uttryckande neuroner från ett eller flera områden i hjärnan vid olika tider på utredarnas val.
Här visar vi att vår FACS protokoll kan användas för att isolera Fos-uttryckande neuroner (och andra celltyper) från både färsk och frusen hjärnvävnad. Som ett exempel, vi isolerade Fos-uttryckande neuroner från råtta striatum efter akut metamfetamin injektioner och från naiva råttor utan injektioner (kontrolltillstånd). Detta kan dock FACS protokoll användas efter någon beteende eller farmakologisk behandling. Efterföljande qPCR analys av våra prover indikerade att genuttrycket från dessa celltyper skulle kunna bedömas med similar effektivitet från både färsk och fryst vävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS kan användas för att sortera neuroner och andra celltyper från antingen färska eller frysta vuxen hjärnvävnad. Som nämndes i inledningen, möjligheten att använda fryst vävnad medger optimalt utnyttjande av prover från djur som har genomgått komplicerade och långdragna beteende förfaranden, såsom själv administration och återfalls studier i beroendeforskning. Dessa beteende förfaranden tar vanligtvis 1-2 h eller längre, och kräver att alla djur (10-20 totalt) testas på samma dag 13,18.</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.
Materials
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A' in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution' in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
Referências
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
- Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
- Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
- Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. Spectrophotometric cell sorter. Science. 156, 1364-1365 (1967).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
- Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
- Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
- US National Research Council. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
- Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
- Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
- Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).
